Gene Editing · CRISPR製造工程
ゲノム編集（CRISPR）の製造工程
Cas9などのヌクレアーゼ（DNAを切る酵素）でゲノムのねらった配列を切り、遺伝子を壊すノックアウトや、配列を入れたり置き換えたりするノックインを行います。他家CAR-Tの拒絶を避けるためのTCR・HLA関連遺伝子の破壊や、遺伝性の病気に対するHSCの改変に使います。編集した細胞そのものが製品なので、編集の正確さが品質を決めます。
製造工程
- 1
標的に合わせgRNAを設計・合成
編集したい場所に合わせて、ガイドRNA（gRNA、Cas9を目的の配列に導くRNA）を設計・合成します。ヒトゲノムの似た配列を避け、意図しない場所を切る（オフターゲット）おそれの小さい配列を選びます。
- 2
Cas9とRNPを形成
gRNAとCas9タンパク質を試験管内で結合させ、リボヌクレオプロテイン（RNP）を作ります。プラスミドやウイルスでCas9を作らせる方法と違い、RNPは短時間だけ働いてすぐ分解されます。外来の配列がゲノムに残るおそれやオフターゲットを抑えやすいので、細胞製品で好んで使われます。
- 3
エレクトロポレーションで細胞へ導入
RNP（ノックインでは鋳型のドナーDNAも）を、エレクトロポレーションで細胞に入れます。T細胞やHSCのような初代細胞は導入が難しく、パルスを強めると入りやすくなる一方で、生存率や分化能が落ちます。細胞の種類ごとに条件を詰め、スケールアップでも再現できるようにします。
- 4
編集効率・オフターゲットを評価
ねらった場所の編集効率と、オフターゲット切断、大きな欠失、転座（染色体の一部が入れ替わること）などを調べます。編集した細胞を患者に投与するので、正確さはそのまま安全性に関わります。デジタルPCRで編集率やノックインのコピー数を測り、配列解析と組み合わせます。
品質管理（QC）の要点
中心は、意図どおりに編集されているか（編集効率）と、オフターゲット切断・大きな欠失・転座という特有のリスクです。
- ノックインでは挿入のコピー数と位置を、ノックアウトでは標的のタンパク質が消えたことを確かめます。
- 生存率と機能、Cas9などの残り、無菌・マイコプラズマ・エンドトキシンも評価し、工程内と出荷時の規格に入れます。
制度・規制の留意点
編集した細胞を投与する製品は、日本では薬機法の再生医療等製品（ヒト細胞加工製品）にあたります。
- 製造は、GCTP省令（製造管理と品質管理の基準）に沿って、CPC（細胞加工施設）で行います。
- 特有の安全上の課題は、オフターゲット変異、大きなゲノムの再構成、造腫瘍性です。
- 他家では、複数の遺伝子を改変することのリスクも考えます。