Gene Therapy · ex vivo製造工程
ex vivo遺伝子改変（レンチ／レトロ）の製造工程
患者やドナーの細胞を体の外に出し、レンチウイルスやレトロウイルスのベクターで遺伝子を入れてから戻します。CAR-Tや遺伝子改変HSCの上流の工程にあたります。ベクターの製造から、細胞に組み込まれた数（VCN）の確認までを、一つの製造工程として管理します。
製造工程
- 1
ベクターを製造（HEK293）
HEK293系の細胞に、パッケージングプラスミドとトランスファープラスミドを一時的に入れ（一過性トランスフェクション）、ベクターを作らせます。産生量が下流の力価を決めるので、試薬、プラスミドの比、培養条件を詰めます。エンベロープ（VSV-Gなど）や自己不活化（SIN）型の設計は、安全性と、感染できる細胞の種類（トロピズム）を左右します。
- 2
TFFで濃縮・精製
培養上清をタンジェンシャルフローろ過（TFF、膜に沿って液を流すろ過）で濃縮し、不純物を除いてバッファを交換します。レンチウイルスはせん断や凍結融解に弱いので、感染力価を落とさない条件を探します。残った宿主細胞DNAやプラスミド、エンドトキシンがどれだけ減ったかも、ここで評価します。
- 3
力価を測定
感染力価（形質導入単位/mL）と物理力価（粒子の数）を測り、その比を品質の目安にします。感染できる粒子の割合はロットで変わりやすく、この力価が次の工程のMOIを決めます。増える能力を持つウイルス（RCL／RCR）がいないことも確かめます。
- 4
細胞へ形質導入
力価からMOI（細胞1個あたりに加える感染性ウイルスの数）を決め、T細胞や造血幹細胞に遺伝子を組み込みます。導入の効率と、細胞の生存率を両立させます。設計によっては、形質導入の前後にエレクトロポレーションによる改変を組み合わせます。
- 5
ベクターコピー数（VCN）を確認
1細胞あたりに組み込まれたベクターの数（VCN）を、qPCRやddPCR（デジタルPCR）で測ります。多すぎると挿入変異のリスクが上がるので、VCNは有効性と安全性の両方に関わる規格です。導入遺伝子の陽性率と合わせて、同一性と一貫性を確かめます。
品質管理（QC）の要点
細胞製品では、同一性（導入遺伝子と表現型）、純度（残ったベクター、宿主細胞DNA）、力価（導入率と機能試験）、無菌・マイコプラズマ・エンドトキシンを確かめます。
- ベクターでは、感染力価と粒子数の比と、RCL／RCRの否定が特有の項目です。
- 細胞では、VCNを決めた範囲に収めます。
- 自家は1ロットが患者1人分で判定を急ぎ、他家はドナーによるばらつきが課題です。
制度・規制の留意点
CAR-Tや遺伝子改変HSCの製品は、日本では薬機法の再生医療等製品にあたります。
- 体内に直接入れるAAVなどの遺伝子治療薬も、同じく再生医療等製品です。
- 製造は、GCTP省令（製造管理と品質管理の基準）に沿って、CPC（細胞加工施設）で行います。
- ゲノムに組み込まれるベクターなので、挿入変異とRCL／RCRの管理が特有の課題で、カルタヘナ法（遺伝子組換え生物の扱いを定める法律）への対応も要ります。