CRISPRのオフターゲット検出：意図しない編集をどう見つけるか

医薬品として体内で編集する場合、意図しない場所の切断は取り返しがつきません。がん関連遺伝子の破壊や染色体の大きな組み換えにつながる可能性もあるため、「どこを、どれくらいの頻度で切ってしまっているか」を投与前に把握することが安全性評価の中心になります。問題は感度だ。頻度が非常に低い部位まで見つけようとすればするほど、測定手法そのものの限界が露わになります。

だからこそ実務では、計算で候補を洗い出し、ゲノム全体を偏りなく実測し、挙がった部位を狙い撃ちで定量する、という順を追った流れで評価が進みます。切ろうとした場所そのもので起きる大欠失や転座といった意図しない結果、検出の感度と閾値の考え方、さらに規制当局が求めるものまで、この一連の手順に沿って見ていくと全体像がつかめます。ウイルスベクター治療用の遺伝子を細胞へ運ぶために改変したウイルス。AAVやレンチウイルスが代表で、遺伝子・細胞治療に使う。の設計や力価測定が「送り届ける側」の品質だとすれば、オフターゲット評価は「編集した結果」の安全性を担保する作業です。

前提：なぜ意図しない場所が切れるのか

評価の手順に入る前に、そもそも何を探しているのかを押さえておきます。Cas9はガイドRNA標的配列を認識してCas9を目的の場所へ導くRNA。編集の宛先を決める部品。と完全一致でなくても、数塩基のずれを許して切ってしまうことがある。これが問題の出発点です。

Cas9ガイドRNAと複合体を作り、指定された配列でDNA二本鎖を切断するヌクレアーゼ。が標的を認識するには、まずPAM標的配列のすぐ隣に必要な短い決まった配列。Cas9が切断する条件になる（SpCas9ではNGG）。（protospacer adjacent motif＝標的配列のすぐ隣にある短い決まった配列。SpCas9では「NGG」）が必要で、その上でガイドRNAの約20塩基がDNAと対合します。問題は、この対合が完全でなくても切断が起こりうる点です。とくにPAMから遠い側（5'側）のミスマッチは許容されやすく、2〜5塩基のずれがあっても切れる部位が実際に見つかります。

さらに厄介なのが「バルジDNA側が1塩基膨らんだり縮んだりする対合。単純な配列類似度では拾えないオフターゲットを生む。」です。DNA側が1塩基膨らんだり縮んだりする対合でもオフターゲットが生じることがあり、単純な配列類似度だけでは拾いきれません。ゲノムは30億塩基あるので、20塩基のうち数塩基違うだけの配列は統計的に何百、何千と存在します。そのすべてが切れるわけではありませんが、どれが実際に切れるかは配列の並びやクロマチンの状態にも左右され、机上の予測だけでは決めきれない。この「予測と実際がずれる」という性質こそが、これから見る多層的な手順が必要になる理由です。

ステップ1：in silico予測で候補を洗い出す

最初の一手は、計算による予測でゲノム上のミスマッチ許容部位を網羅的に列挙すること。実験を始める前に、どこを疑うべきかの見取り図を作ります。

代表的なツールがCas-OFFinderガイド配列とPAM、許容ミスマッチ数を指定すると、参照ゲノム上の該当部位を列挙する検索ツール。です。ガイド配列とPAM、許容するミスマッチ数やバルジ数を指定すると、参照ゲノム上で条件に合う部位をすべて列挙してくれる検索ツールです。切断頻度を予測するのではなく、「対合しうる場所」を漏れなく挙げることに主眼があります。機械学習で切断されやすさをスコア化するツール（CFD流れをシミュレーションし、タンク内の局所pH分布などを評価する数値解析のこと。スコアなど）も併用されます。

この段階の長所は、低コストで全体像をつかめる点です。一方で弱点もはっきりしている。第一に、参照ゲノムに載っている配列しか見ないため、患者集団の遺伝的多型でできた「その人固有のオフターゲット部位」を取りこぼします。第二に、切断のしやすさはクロマチンの開き具合など配列以外の要因にも依存するため、予測部位が実際に切れるとは限らず、逆に予測されなかった部位が切れることもあります。予測はあくまで候補リストであり、これだけで安全と結論づけることはできません。だからこそ、次の実測へ進みます。

ステップ2：ゲノムワイド実測で偏りなく探す

続いて、予測に頼らずゲノム全体から実際の切断・編集部位を拾い上げます。規制当局も、in silico予測計算でゲノム上のミスマッチ許容部位を網羅的に列挙する、オフターゲット候補の洗い出し。に加えて偏りのない（unbiased）実測を組み合わせる考え方を示しています。

実測法は、測る場所によって大きく三つに分かれます。細胞の中で測るもの、生化学的に試験管内で測るもの、生体内で測るもの——それぞれ狙いと得意分野が異なります。

• GUIDE-seq短い二本鎖DNAを切断部位に取り込ませて目印にし、細胞内の切断部位をシーケンスで拾う実測法。⁠：細胞に短い二本鎖DNA（dsODN）を入れておき、Cas9が切ったDSB（二本鎖切断DNAの二本鎖切断。Cas9が作る傷で、その修復のされ方が編集の結果を左右する。）にそれが取り込まれるのを目印にして、切断部位をシーケンスで拾う方法です。細胞内の実態を反映する定番手法として広く使われます（Tsaiら, 2015）。
• CIRCLE-seq精製ゲノムDNAを環状化してCas9で切り、切断点を読む試験管内の実測法。感度が高い。 / CHANGE-seq精製ゲノムDNAを環状化してCas9で切り、切断点を読む試験管内の実測法。感度が高い。⁠：精製したゲノムDNAを環状化してからCas9で切り、その切断点をシーケンスする試験管内の方法です。細胞由来のノイズが少なく感度が高いのが特長で、CHANGE-seqはこれを高スループット一定時間に処理できる検体数。自動パッチクランプはマニュアル法より桁違いに多くの化合物を測れる。化した発展版です（Tsaiら, 2017／Lazzarottoら, 2020）。
• Digenome-seqCas9消化したゲノムDNAを全ゲノムシーケンスし、切断点がそろう位置から部位を割り出す実測法。⁠：試験管内でCas9消化したゲノムDNAを全ゲノムシーケンスし、切断点がそろう位置から部位を割り出す方法です（Kimら, 2015）。
• DISCOVER-seq修復タンパク質MRE11が切断部位に集まる性質を使い、外来の目印なしで切断部位を検出する実測法。生体内でも使える。⁠：DNA修復タンパク質MRE11がDSBに集まる性質を利用し、外来の目印を入れずに切断部位を検出する方法です。生体内（in vivo生きた動物の体内で試験を行うこと。物質が吸収・代謝を受けた実際の状態での影響を見られる。）での編集にも使える点が強みです（Wienertら, 2019）。

これらは測る場所（細胞内／試験管内／生体内）が違うため、拾える部位も一致しません。試験管内の手法は感度が高く候補を広く拾える一方、細胞内では切れない部位も含みがちです。そのため、感度の高い実測法で広く候補を挙げ、次の標的NGS候補部位をPCRで増やして深く読み、indelの割合を部位ごとに定量する検証手法。で実際の編集を確かめる二段構えが定石になります。

ステップ3：標的NGSで一つずつ検証する

ゲノムワイド実測予測に頼らず、ゲノム全体から実際の切断・編集部位を偏りなく拾い上げるオフターゲット評価。が挙げるのは「切れうる候補部位」です。次のステップでは、その部位で実際にどれくらいの頻度で編集（挿入・欠失DNAの塩基の挿入・欠失。NHEJで生じ、遺伝子の読み枠をずらす。＝indelDNAの塩基の挿入・欠失。NHEJで生じ、遺伝子の読み枠をずらす。）が起きているかを、部位ごとに定量します。

ここで使うのが標的アンプリコンシーケンス候補部位をPCRで増やして深く読み、indelの割合を部位ごとに定量する検証手法。です。候補部位をPCRで増やしてから深く読み、indelの割合を数えます。rhAmpSeqのように、多数の部位をまとめて増幅・定量できるパネル型の手法も用いられます。

この段階で効いてくるのが検出感度と閾値です。標的NGSではシーケンスのエラー率が背景ノイズになるため、それを下回る低頻度の編集は見分けられません。おおまかには0.1〜1%あたりが実務的な下限の目安になり、それより低い頻度を確実に見たい場合はUMI（分子バーコード一分子ごとに付ける分子バーコード。シーケンスのエラーを補正し、低頻度の編集を見分ける。）でエラーを補正するなどの工夫が要ります。「オフターゲットが検出されなかった」という結論は、常に「この感度では検出されなかった」という条件つきで読む必要がある。どの部位を、どの感度で確認したかをセットで記録することが、評価の信頼性を支えます。

見落としやすい局面：オンターゲットで起きる意図しない結果

ここまでの三段階は「別の場所を切る」オフターゲットを追う流れでした。ところが、正しい場所を切った場合でも安全性上の懸念が残る、という別の局面があります。

DSBDNAの二本鎖切断。Cas9が作る傷で、その修復のされ方が編集の結果を左右する。の修復は必ずしも小さなindelでは済みません。切断点をまたいで数キロ塩基規模の大欠失切断点をまたいで数キロ塩基規模でDNAが失われる意図しない結果。短い解析では見落とされやすい。が起きたり、離れた切断部位どうしがつながる転座⁠、さらには染色体の一部を失う染色体異常⁠（ときにchromothripsis染色体の一部が一度に多数の断片へ砕け、ばらばらの順序でつなぎ直される大規模な再編成。ゲノム編集で報告される染色体異常のひとつ。と呼ばれる大規模な再編成）が報告されています。

見落とされやすい落とし穴がある。こうした大きな構造変化は、ステップ3で使う短いアンプリコンを読む通常の標的NGSでは検出されにくいのです。短い断片しか見ていないと、その断片ごと失われた大欠失は「編集なし」に見えてしまうことがあります。そのため、切断点から離れた位置も含めて長めに解析する、ロングリードシーケンス長いDNA断片をまとめて読むシーケンス。短い解析では見落とす大欠失など構造変化の検出に用いる。や定量的な手法（ddPCR反応液を無数の微小区画に分けて増幅し、陽性区画の数から核酸の量を絶対値で数える装置です。ごく微量の検出や定量に強みがあります。詳しく →など）を併用する、染色体レベルの異常を細胞遺伝学的手法で確認する、といった補完が検討されます。オンターゲットの安全性は、indel率だけでは語りきれません。

手順の外側：低減の工夫と規制の求め方

最後に、この検出の流れを取り巻く二つの動き——オフターゲットを抑える技術と、それを評価する規制の枠組み——を見ておきます。両者は車の両輪です。

技術面では、オフターゲット自体を減らす方向の進歩があります。高忠実度（high-fidelity）Cas9は、Cas9とDNAの余分な相互作用を弱める変異を入れることで、ミスマッチ部位での切断を起こりにくくした改変酵素です（eSpCas9やHiFi Cas9DNAとの余分な相互作用を弱める変異を入れ、ミスマッチ部位での切断を起こりにくくした改変Cas9。など）。さらに、DSBを作らずに編集するベース編集⁠（塩基を化学的に別の塩基へ書き換える）やプライム編集⁠（部分的な逆転写で狙った改変を書き込む）は、切断に伴う大欠失や転座のリスクを構造的に下げられる方向として注目されています。ただしこれらにも固有のオフターゲット（たとえばベース編集ではガイドと無関係にRNAやDNAを書き換えてしまう現象）があり、評価の観点が変わる点には注意が要ります。

規制面では、FDAが2024年1月に確定した「Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing」ガイダンスで、in silico予測と偏りのない実測を組み合わせ、検出された部位を標的NGSで検証するという多層的なアプローチを求めています。これは本稿で追ってきたステップ1から3の流れと重なります。あわせて、大欠失などオンターゲットの意図しない結果も評価対象として挙げられています。非臨床安全性の一般的な枠組みはICH S12（遺伝子治療製品の非臨床生体内分布評価）などの国際的な考え方とも整合させて設計します。単一の手法で安全と結論づけるのではなく、予測・実測・検証を順に重ね、感度と閾値を明示すること——それが評価の骨格です。

参考文献

• Tsai SQ, Zheng Z, et al. "GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases." Nature Biotechnology 2015. PMID: 25513782
• Tsai SQ, Nguyen NT, et al. "CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets." Nature Methods 2017. PMID: 28459458
• Lazzarotto CR, et al. "CHANGE-seq reveals genetic and epigenetic effects on CRISPR–Cas9 genome-wide activity." Nature Biotechnology 2020. s41587-020-0555-7
• Kim D, Bae S, et al. "Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells." Nature Methods 2015. PMID: 25664545
• Wienert B, et al. "Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq." Science 2019. PMID: 31000663
• Bae S, Park J, Kim JS. "Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases." Bioinformatics 2014. PMID: 24463181
• U.S. FDA. "Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing — Guidance for Industry." 2024. FDA guidance
• ICH. "S12 Nonclinical Biodistribution Considerations for Gene Therapy Products." 2023. ICH S12