Protein Aレジンの寿命とは？使える回数を何で決めるのか

Protein A抗体に特異的に結合するProtein Aを担体に固定し、抗体だけを選択的に捕まえて精製する手法です。抗体医薬の最初の精製工程として定番になっています。詳しく →レジンクロマトグラフィーで目的物や不純物を結合させる粒子状の充填材。精製モードごとに使い分ける。詳しく →の寿命は、抗体の精製の最初の工程で使うレジンを、品質を保ったまま繰り返し使える最大の回数です。抗体の製造で精製を担う技術者が工程の条件を決め、購買が発注の時期を決めるときに、前提として使う数字です。

ただし、この回数はレジンのカタログを見ても決まりません。同じレジンでも、洗い方や培養液の汚れ方が違えば、品質を保てる回数は変わるからです。

回数が原価をどれだけ動かすのか、自社の回数を何を測って決めるのか、決めたあとに何を確かめ続けるのかが分かります。

1. Protein Aレジンの寿命とは、何の回数なのか

抗体を載せて、洗い、溶出し、再生する一連の運転（サイクル）を、品質を保ったまま繰り返せる最大の回数です。 Protein Aは抗体の根もと（Fc領域抗体の定常部にあたる「足」の部分。FcγRや補体、FcRnと相互作用し、機能や血中半減期を担う。詳しく →）をつかむタンパク質で、レジンのビーズに固定して使います。このタンパク質を、ビーズに付けた「リガンド」と呼びます。

回数を重ねると、レジンの状態は少しずつ変わります。何を見て「品質を保っている」と判断するかについて、欧州医薬品庁（EMA）のバイオ原薬のプロセスバリデーション決めた製造工程が、いつも安定して規格に合う製品を作れることを事前に実証し、その後も確認し続ける取り組みです。承認申請や品質保証の土台になります。詳しく →の指針は、カラムを想定する寿命の全体にわたって、次の点で評価すべき（should）としています。

• 精製の能力⁠：不純物を除く力や、ピークの分かれ方が保たれているか。
• リガンドの漏れ出し⁠：レジンから外れたリガンドが、溶出液に混じってこないか。

漏れ出しの試験は、レジンによっては理由を示せば省けるとされています。

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漏れ出したリガンドは、下流の工程で取り除くべき不純物として扱います。寿命は、レジンが壊れて使えなくなる日ではありません。製品の品質を保てる範囲の、使用回数の上限です。

2. なぜ、使える回数がそれほど問題になるのか

レジンは高価で、使える回数で割った単価が、抗体1 gあたりの原価を大きく変えるからです。 レジンメーカーの Cytiva の試算では、Protein Aレジンの代金を作った抗体1 gあたりに直すと、5回ほどの使用で約67ドル、100回で約3ドルでした。

同じ試算は、2,000 Lの培養液を抗体濃度3 g/Lで精製する使い捨ての工程を例に、Protein Aレジンが総コストに占める割合も示しています。臨床試験用に4バッチを作る場合は19%、レジンを200回使う商用の製造では3%でした。

ここで効いているのは、レジンの寿命を使い切れるかどうかです。少ないバッチで使い終える段階ではレジン代が重く、使い回せる回数が増えるほど軽くなります。

ただし、単価が下がるのは、その回数のあいだ品質が保たれる場合だけです。100回使う計画で買ったレジンが途中で基準を割れば、予定より早い交換が要り、計画した原価は成り立ちません。回数を何で決めるかは、原価の計画そのものの話です。

3. カタログの回数を、なぜ自社の寿命にできないのか

寿命はレジンだけの性質ではなく、レジンと自社の運転条件の組み合わせで決まるからです。 洗浄に使うアルカリの濃さや時間、溶出のpH、載せる培養液の汚れ方が違えば、同じレジンでも劣化の速さは変わります。

レジンごとの差も、指標ごとに違って現れます。2006年に報告された寿命試験（Hahn ら）では、高容量のProtein Aレジン3種に、工業的な抗体精製の手順に沿って洗浄も含めた50回の精製を繰り返しました。

• 精製の性能⁠：電気泳動（SDS-PAGE）と分析用のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）多孔性樹脂の孔に小分子ほど入り込む時間差を利用し、分子をサイズで分けるクロマトグラフィー。詳しく →で見るかぎり、3種とも50回で大きな低下はありませんでした。
• リガンドの漏れ出し⁠：アルカリでの再生に耐えるリガンドを使ったレジンは1〜3 ppm、ほかの2種は30〜40 ppmで、同じ運転でも10倍以上の差がありました。

精製の性能が保たれていても、漏れ出しの水準はレジンによって大きく違います。性能の指標だけを見ていると、この差には気づけません。

⁠カタログの回数は、メーカーが決めた条件での値で、自社の寿命は自社の条件で測ってはじめて決まります。 レジンの性能を比べるときの見方は動的結合容量の測り方に、漏れ出したリガンドの測り方はProtein Aリガンド漏出にまとめています。

4. 自社の回数は、どうやって決めるのか

実機と同じ運転条件の小さなカラムで想定する回数まで繰り返し、性能と漏れ出しの推移から、最大の使用回数を決めます。 実機の大きなカラムで何十回、何百回も試すことは、レジンの量と製造の枠から見て現実的ではありません。

EMA の指針も、寿命の評価に要るサイクルの数を考えると、申請の時点で最大の回数を見積もって決めるには、小スケールの試験が適切と考えられるとしています。ただし、承認申請のときに認められた手順に沿って、商業スケールでカラムの性能と状態を継続して確かめることが条件です。

小さなカラムの結果を実機に当てはめるには、運転の条件をそろえます。指針は、カラムに載せる量、流す速さ、カラムの長さ、溶出・洗浄・再生の条件を、評価すべき工程条件の例に挙げています。精製工程の縮め方は精製工程のスケールダウンで、小さな系が実機を代表すると示す方法はスケールダウンモデルの適格性評価で説明しています。

回数ごとの測定値を並べると、劣化の傾きが見えてきます。最大の回数は、基準を割った回数そのものではなく、その手前に置きます。どこまで余裕を見るかは、劣化の傾きと、基準を割ったときに失うものの大きさで決めます。

こうして決めた回数は、実機で確かめ続けて初めて根拠として使えます。回数を決めたあとの交換の判断はProtein Aレジンは何サイクルで交換すればいい？で扱っています。

5. 回数を決めるとき、引き直すときに確かめること

最初に確かめるのは、いま使っている回数が、自社の条件で試験して決めたものか、カタログの値かです。 カタログの値のまま運転しているなら、自社の運転で品質を保てる根拠がありません。

決めるときと、見直すときに、次の順で確かめます。

• 回数の出どころを確かめる⁠：自社の小さなカラムでの寿命試験で決めた回数か、その試験の運転条件は実機と同じかを見ます。
• 見る指標がそろっているか⁠：回収率や精製の性能に加えて、リガンドの漏れ出しを回数ごとに測っているかを確かめます。性能が保たれていても、漏れ出しが上がっていれば交換を考えます。
• 余裕の根拠を書く⁠：基準を割ると予測される回数から、どれだけ手前に線を置いたかと、その理由を残します。
• 実機で確かめ続ける手順があるか⁠：ロットごとの回収率、漏れ出し、カラムの圧やピークの形を記録し、決めた回数の内側で品質が保たれているかを見ます。
• 引き直す条件を決めておく⁠：レジンを替えたとき、洗浄や溶出の条件を変えたとき、培養液の性質が変わったときは、寿命試験の前提が変わります。どの変更で試験をやり直すかを、先に決めます。
• 発注の時期を合わせる⁠：残りの使用回数と、レジンの発注から納品までの期間を並べ、交換の時期に在庫が間に合うかを購買と確かめます。

洗浄のアルカリの濃さの決め方はProtein Aレジンの寿命を延ばす定置洗浄（CIP）に、再生と洗浄の流れはProtein Aレジンの再生・CIPに、レジンを使い切る連続精製の考え方は複数のカラムを切り替える連続精製にあります。漏れ出しの測定は残存Protein Aの酵素免疫測定（ELISA）、小さなカラムでの検討はプレパックカラムの製品ページで比べられます。

参考文献

• EMA, Guideline on process validation for the manufacture of biotechnology-derived active substances and data to be provided in the regulatory submission（EMA/CHMP/BWP/187338/2014。カラムの寿命と小スケールでの最大回数の設定は 6.2.1）
• Hahn R, Shimahara K, Steindl F, Jungbauer A. Comparison of protein A affinity sorbents III. Life time study. J Chromatogr A. 2006;1102(1-2):224-231.（高容量のProtein Aレジン3種の50サイクルの寿命試験、精製の性能とリガンドの漏れ出し）
• Cytiva, Balancing protein A resin cost, performance, and productivity（使用回数と抗体1 gあたりのレジン代、総コストに占める割合の試算）