組織工学・細胞シートの作り方とは？足場・3D組織・オルガノイド

ただし、「細胞を三次元に組み上げる」工程は平面のシートだけにとどまらない。コラーゲンやハイドロゲルといった足場（スキャフォールド）に細胞を播種して立体構造を作る方法、幹細胞を基底膜マトリックスと因子の中で自己組織化させるオルガノイド、バイオインクを細胞ごと積層する3Dバイオプリンティング細胞を混ぜたバイオインクをノズルから吐出・積層し、設計した形状の立体構造を造形する技術。と、アプローチは多様化しています。

「三次元の組織を作る」という目的は同じでも、温度応答性培養皿でシートを剥がすのか、足場材に播種するのか、細胞自身の自己組織化に任せるのか、バイオインク細胞を含んだゲル状の材料で、3Dバイオプリンティングで組織構造を積層造形する際の「インク」として使います。詳しく →で積層するのかで、出発材料も装置も品質の管理点もまるで違ってきます。工程を設計する実務者にとって問われるのは治療効果よりも手前の話——どの工程で何を作り、その良し悪しをどこで見極めるか、という技術的な判断軸です。

細胞シート工学と温度応答性培養皿

細胞シート工学酵素でばらさず、細胞間結合と細胞外マトリックスを保ったままシート状に細胞を回収する手法。の中心にあるのが、温度応答性ポリマー poly(N-isopropylacrylamide)（PIPAAm）を表面にグラフトした培養皿です。37℃ではポリマー層が疎水性分子が水と親和せず、油脂や非極性溶媒と相互作用しやすい性質で、二本鎖RNAと一本鎖RNAではその程度が異なり分離の指標となる。となり、細胞は通常どおり接着・増殖する。培養皿の温度を約32℃以下に下げるとポリマーが水和して親水性に変わり、細胞が自発的に剥離します。

通常の継代ではトリプシンなどの酵素で接着タンパク質を分解して細胞を回収しますが、この方法では細胞間結合と、細胞が自ら作った細胞外マトリックス細胞が自ら分泌し、細胞の周囲を埋めて接着や組織の構造を支える物質の総称。が温存されます。結果として回収できるのは、細胞がつながった一枚のシート。剥離した側の接着分子はそのまま次の足場や別のシートへの接着に使えます。複数枚を重ねれば血管網を含むより厚い三次元組織を構築する研究も進んでいます。

温度応答性培養皿は、酵素を使わずに細胞外マトリックス分析対象物が含まれる試料の背景成分（緩衝液・血清・細胞培養液など）の総称で、測定値に影響を与えうる。ごと細胞をシート状に回収するための基盤デバイスである。

シートの回収・移植では、薄く破れやすいシートのハンドリングが課題になります。専用の支持膜（キャリア）やプランジャー状の器具で形状を保ったまま転写する工夫が用いられており、これらのデバイスや消耗品は 温度応答性 細胞培養皿 として整理しています。

足場材・スキャフォールドへの播種

シート法が「足場を使わない（scaffold-free）」であるのに対し、足場材を起点に立体組織を構築するアプローチもあります。多孔質のスポンジ状コラーゲン、脱細胞化組織組織から細胞成分を取り除き、細胞外マトリックスの立体構造を残して足場材料としたもの。、合成高分子（PLGAなど）、あるいはハイドロゲル多量の水を含むゲル状材料。柔らかい組織向けの足場やバイオインクの担体に使う。に細胞を播種し、足場の形状と力学特性を細胞に与えながら培養する方法です。

足場には大きく二つの役割があります。一つは細胞が接着・増殖する物理的な土台の提供、もう一つは多孔率・分解速度・弾性率といったパラメータを通じた組織形成の誘導です。軟骨や骨のように硬い組織には剛性の高い足場、柔らかい組織には低弾性のハイドロゲルというように、目的組織に合わせた材料設計が求められます。分解性の足場では、細胞が自前のマトリックスを産生する速度と足場が分解する速度のバランスが品質を左右します。

足場材細胞が付着し立体的に増殖・組織化するための土台となる材料で、ハイドロゲルなどを用いて組織工学に使います。詳しく →は単なる土台ではなく、多孔率・分解速度・弾性率を通じて組織形成そのものを方向づける設計要素である。

懸濁培養細胞を容器壁に付着させず液中に浮遊させて増やす培養。バイオリアクターでの大容量化に向く。で大量の細胞を増やす場面では、ビーズ表面に細胞を接着させて撹拌培養する マイクロキャリア も足場の一種として使われます。足場材の素材・形状の選択肢は 足場材・スキャフォールド にまとめています。

オルガノイドと3Dバイオプリンティング

オルガノイドは、幹細胞（多能性幹細胞や組織幹細胞）の自己組織化能力を利用して、臓器の微細構造の一部を体外で再現した三次元構造体です。基底膜マトリックス幹細胞から臓器を模した立体構造（オルガノイド）を育てるためのキットで、基底膜マトリックスなどの環境を提供します。詳しく →（ラミニン支持細胞（フィーダー）を使わずに幹細胞を培養するため、培養皿表面をラミニンやビトロネクチンなどの接着タンパクでコーティングする基材です。詳しく →やコラーゲンIVを主成分とするゲル）の中に細胞を包埋し、組織ごとに異なる成長因子・低分子化合物のカクテルを与えて分化と空間配置を促します。腸・肝・腎・脳などのオルガノイドが、疾患モデルや創薬スクリーニング、毒性評価の用途で研究されています。

3Dバイオプリンティングは、細胞をゲル状の担体に分散させた「バイオインク」を、設計した形状にノズルから吐出・積層して立体構造を造形する技術です。バイオインクには、細胞を保護しつつ印刷後に形状を保てる粘弾性と、印刷後にゲル化（架橋）できる性質が求められます。代表的な造形方式には押し出し（エクストルージョン）方式、インクジェット方式、光硬化を用いる方式などがあり、解像度・細胞生存率細胞集団のうち生きている細胞の割合。凍結・培養の品質を示す基本指標。・造形速度のトレードオフは方式ごとに異なります。

オルガノイドは細胞の自己組織化に造形を委ね、バイオプリンティングは外部から形状を規定する点で、三次元化のアプローチが対照的である。

オルガノイド培養に必要な基底膜マトリックスや因子セットは オルガノイド培養キット、造形材料は バイオインク として扱っています。

三次元化手法の比較

ここまで挙げた手法は、足場の有無や形状の決まり方が異なります。主な工程要素を整理すると次のとおりです。

工程設計では、目的組織に必要な力学・空間構造と、利用できる細胞源（自家＝autologous患者本人の細胞を採取・加工して同じ患者に戻す細胞治療の方式。1患者1ロットで製造する。／他家＝allogeneic健常ドナーやiPS株など患者以外の細胞源から大ロットを作り、凍結在庫として供給する細胞治療の方式。）の両面から手法を選びます。これらの多くは研究段階・開発段階にあり、製品として承認・実用化されている範囲は組織や手法によって大きく異なる点に留意が必要です。

応用領域と製造上の留意点

応用の代表例としては、角膜上皮の細胞シート、心筋（拍動する筋組織）シート、軟骨組織、皮膚、歯周組織などがあります。いずれも目的組織の構造・力学特性に合わせて手法・材料・細胞源が選択されます。組織が厚くなるほど内部への酸素・栄養の供給（血管化）が課題となり、シートの多層化やプリンティングによる血管構造の作り込みなど、複数のアプローチが検討されています。

製造の観点では、立体組織は最終製品を分解せずに内部まで品質を確認することが難しい。そのため工程内管理——プロセス内での細胞数・生存率・分化マーカーの確認——の比重が必然的に高くなります。無菌操作、原材料（足場材・マトリックス・因子）のロット管理とトレーサビリティ要求と検証を一対一で結びつけ追跡できるようにすること。抜け漏れと過剰検証の両方を防ぐ。、ハンドリングによる構造の損傷防止も重要な管理点です。

立体組織は最終製品の非破壊評価が難しいため、工程内管理工程の途中で中間体の力価や純度などを確認する管理。最終規格の前に品質を作り込む要素。と原材料の品質管理遺伝子治療製品の品質・安全性・有効性を保証するために製造・出荷の各段階で実施する試験・管理の総体。が製造の信頼性を支える。

これらの製品群と関連する装置・試薬・サービスの全体像は 再生医療 製品ガイド から横断的にたどれます。

まとめ

組織工学生きた細胞・足場材料・生体因子を組み合わせ、機能を持つ組織を体外で構築する技術領域。は、足場フリーの細胞シート工学、足場材への播種、自己組織化を利用するオルガノイド、設計データで造形する3Dバイオプリンティングという複数のアプローチで三次元組織の構築を目指します。手法ごとに材料・装置・品質の管理点は異なり、目的組織の構造と細胞源（自家・他家）に応じて選択されます。多くは研究段階・開発段階にあり、立体組織は非破壊評価が難しい——だからこそ工程内管理と原材料製造の起点となる原料で、その品質や持ち込む不純物が最終製品の品質に影響しうるため、規格管理が重視される物質。管理が製造上の鍵になります。

参考文献

ガイドライン・基準

• ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation（International Society for Stem Cell Research）. https://www.isscr.org/guidelines
• 再生医療等製品の規制（再生医療等安全性確保法／医薬品医療機器等法）（医薬品医療機器総合機構 PMDA）. https://www.pmda.go.jp/english/review-services/reviews/0003.html
• Cellular & Gene Therapy Products（U.S. FDA, Center for Biologics Evaluation and Research / CBER）. https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products
• Advanced Therapy Medicinal Products (ATMP): Overview（European Medicines Agency / EMA）. https://www.ema.europa.eu/en/human-regulatory-overview/advanced-therapy-medicinal-products-overview

主な文献

• Nishida K, et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 2004;351(12):1187-1196. PMID: 15371576. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15371576/
• Okano T, et al. A novel recovery添加した既知量の標準物質に対して試験で実際に測定された値の割合を示す指標で、試験の正確さを表す。 system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 1993;27(10):1243-1251. PMID: 8245039. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8245039/
• Kwon OH, et al. Rapid cell sheet detachment from poly(N-isopropylacrylamide)-grafted porous cell culture membranes. J Biomed Mater Res. 2000;50(1):82-89. PMID: 10644967. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10644967/
• Miyagawa S, et al. Phase I Clinical Trial of Autologous Stem Cell-Sheet Transplantation Therapy for Treating Cardiomyopathy. J Am Heart Assoc. 2017;6(4):e003918. PMID: 28381469. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28381469/