セルストレーナーの選び方とは？目開きと材質で決まる細胞の通り方

何のために通すのか

フローサイトメトリー細胞を一つずつ測定し、表面マーカーや性質を調べる手法です。細胞の種類・純度・活性の確認に使います。詳しく →のアポートが止まったとき、原因がノズルの詰まりだと分かった経験はないでしょうか。セルストレーナー細胞懸濁液を網目に通して細胞の塊や組織片を取り除き、ばらけた単一細胞に近い状態にそろえるためのフィルターです。詳しく →（cell strainer）は、そうした詰まりを未然に防ぐために細胞懸濁液を通す、メッシュ状フィルターを持つ小さな器具です。⁠細胞の塊、未解離の組織片、デブリ破砕で生じる細胞の破片。過度な破砕で微細化すると後段の遠心・ろ過を妨げる。を取り除くのが役割であり、液を澄ませることが目的ではありません。⁠細胞を1個ずつばらばらの状態に近づけること⁠—それが本来の目的です。

なぜ単細胞に近い状態が必要なのか。下流の多くの操作が「細胞が1個ずつ独立していること」を前提に設計されているからです。

• 細胞数の計数⁠：塊があると、何個ぶんなのか判定できません。自動セルカウンターでも塊はしばしば1個として数えられ、実際より少ない値が出ます。
• フローサイトメトリー⁠：塊はノズルやフローセル液体サンプルを一定の流れで流しながら光学的に撮像・計測するための、装置内部に組み込まれた薄い流路構造体。を詰まらせ、測定そのものを止めます。
• 播種⁠：塊のまま播くと、密度が場所によってばらつきます。
• シングルセルクローニング：1ウェルに1細胞であることが前提なので、塊は成立条件を壊します。

目開きの選び方

一般的なセルストレーナーの目開きは40µm、70µm、100µm。選ぶ基準は2つあります。

1つ目は、通したい細胞の大きさです。 目開きが細胞より小さければ、細胞そのものが引っかかります。培養細胞の多くは10〜20µm程度なので40µmでも通過できますが、大きい細胞や伸展した状態の細胞では、余裕を見た目開きを選ぶ必要があります。

2つ目は、下流の操作で何が詰まると困るかです。 フローサイトメトリーのように細い流路を通す場面では、詰まりの原因を確実に排除したいので細かい目開きが要ります。一方、播種して培養するだけなら、小さな塊は培養中にほどけることもあるため、粗くて構いません。

実務上の目安としては、次の考え方が使えます。

• 40µm⁠：フローサイトメトリー、セルソーティング、シングルセル解析の前処理細胞移植の前に患者へ行う処置。生着の場を空けるために既存の骨髄細胞を減らす目的で実施される。。詰まりを最も嫌う場面。
• 70µm⁠：組織解離薬分子が水溶液中で電荷を帯びたイオン型と電荷を持たない非イオン型に分かれる現象で、体内のpH環境によって割合が変化する。後の一次処理、リンパ球など小型細胞の調製。汎用的な位置づけ。
• 100µm⁠：大きな組織片を粗く落とす最初の段階。この後さらに細かいメッシュに通す前提。

組織から細胞を取り出す場合は、⁠粗いメッシュから細かいメッシュへ段階的に通すのが定石です。いきなり40µmに通すと大きな組織片でメッシュが塞がり、その後の液が流れなくなります。

細かくすれば良いわけではない

「詰まりが困るなら、常に最も細かいものを使えばよい」とはいきません。メッシュを通すこと自体が、細胞にストレスを与えるためです。

• せん断流れの中で分子にかかる物理的な力。強すぎると抗体の凝集や微粒子発生を招く。による損傷⁠：細い隙間を通るとき、細胞は変形を強いられます。もともと弱っている細胞、大型の細胞、初代培養組織から分離した細胞を最初に立ち上げる培養。ドナー差により性質がばらつきやすい段階です。の細胞では、通過後に生存率細胞集団のうち生きている細胞の割合。凍結・培養の品質を示す基本指標。が落ちることがあります。
• 回収率添加した既知量の標準物質に対して試験で実際に測定された値の割合を示す指標で、試験の正確さを表す。の低下⁠：メッシュに引っかかる細胞、器具の壁に残る細胞のぶんだけ、回収できる数が減ります。希少な細胞を扱う場面では無視できません。
• 目的の集団の偏り⁠：大きい細胞ほど引っかかりやすいので、細かいメッシュを通した後の集団は、元の集団より小型細胞に偏る可能性があります。

したがって、⁠下流の操作が許容する範囲で、できるだけ粗い目開きを選ぶのが合理的です。詰まりを避けたい一心で細かくすると、測りたかった細胞そのものを失うことがあります。

通し方で結果が変わる

同じストレーナーを使っても、通し方で回収率と生存率は変わります。

• 無理に押し込まない⁠：ピストンで押し出すと、通過時のせん断が強くなります。自重で落ちる速さを基本にします。
• 塊が溜まったら替える⁠：メッシュ上に塊が積もると、実質的な目開きが細かくなり、後半ほど細胞が通らなくなります。処理量に対してメッシュが小さすぎないか、事前に確認します。
• 前もって湿らせる⁠：乾いたメッシュは細胞が張り付きやすく、回収率が落ちます。バッファで濡らしてから使います。
• 洗い込む⁠：通した後、メッシュを少量のバッファで洗うと、残った細胞を回収できます。ただし液量が増えるので、この後の濃縮工程との兼ね合いで決めます。

解離が足りないときの見分け方

ストレーナーで塊が多く取れる場合、原因はその前の解離工程が不十分であることがほとんどです。ストレーナーは塊を「取り除く」器具であって、「ほどく」器具ではありません。塊のまま除かれた細胞は、そのまま回収率の損失になります。

解離が足りているかは、通す前の懸濁液を顕微鏡で確認すれば判断できます。塊が目立つなら、細かいメッシュへ替えるより、酵素処理の時間や濃度、機械的な処理の強さを見直すほうが結果は改善します。ただし、解離を強めすぎると今度は生存率が落ちます。両側から条件を絞り込むかたちで、最適点を探ることになります。

まとめ

• セルストレーナーは細胞を1個ずつに近づける仕上げの器具。液を澄ませるためのものではない。
• 目開きは40・70・100µmが代表。通したい細胞の大きさと、下流の操作が何を嫌うかで選ぶ。
• 細かくするほど塊は取れるが、せん断で生存率が落ち、回収率も下がり、集団が小型側に偏りうる。
• 塊が多いときは、メッシュを細かくするより前段の解離条件を見直すほうが効く。

参考文献

• 日本薬局方 参考情報「細胞加工製品の品質管理遺伝子治療製品の品質・安全性・有効性を保証するために製造・出荷の各段階で実施する試験・管理の総体。」（厚生労働省）