高次構造解析とは？ CD・DSC・FTIRで立体構造を評価する

高次構造の評価が一筋縄ではいかないのは、配列のように「一列に並べて読む」ことができないからです。そこで、分子全体の折りたたみを間接的に映す物理量を測ります。代表的なのが、円二色性（CD＝Circular Dichroism左右の円偏光に対する吸収差を波長ごとに測り、二次・三次構造を溶液のまま非破壊で評価する手法。、光の左右円偏光の吸収差から二次構造を推定）、示差走査熱量測定温度を上げながら分子がほどける際の熱の出入りを測り、融解温度（Tm）を求める手法。（DSC＝Differential Scanning Calorimetry、加熱時の熱の出入りから安定性を測る）、赤外分光赤外光の吸収パターンから分子の官能基や物質を同定する分光法です。ATRは試料を前処理なく手軽に測れる方式です。詳しく →（FTIR＝フーリエ変換赤外分光、分子の振動から二次構造αヘリックスやβシートなど、主鎖が局所的に取る規則的な折りたたみ様式。遠紫外CDで割合を推定する。を読む）の3手法です。

同じ「立体構造の評価」でも、CD・DSC・FTIRが見ている階層も原理も違います。その違いが、製剤開発・比較可能性評価製造工程や試験法の変更前後で製品品質が同等であることを、規定の試験・統計的基準に基づいて確認する評価。・凝集リスク評価工程や製品に潜在するリスクの種類・発生可能性・影響度を系統的に特定・分析し、優先的に管理すべき項目を決定する手続き。という実務で、どの手法をどう組み合わせるかを左右します。

高次構造とは何を指すのか

タンパク質の構造は、慣習的に4つの階層で語られます。

高次構造アミノ酸鎖が折りたたまれてできる立体構造。二次・三次構造などの階層があり、品質特性として評価する。という言葉は、このうち二次以降——折りたたみと会合の状態を指します。一次構造が同じでも、折りたたみが崩れれば別の分子として振る舞います。抗体の抗原結合が三次・四次構造に依存する以上、高次構造は有効性と安全性に直結する品質特性です。

CD・DSC・FTIRに共通するのは、高次構造を非破壊で・溶液のまま測れることです。結晶化やタグ付けを要さず製剤に近い条件で見られるため、開発から品質管理遺伝子治療製品の品質・安全性・有効性を保証するために製造・出荷の各段階で実施する試験・管理の総体。まで幅広く使われます。

円二色性（CD）：二次構造と三次構造を光で見る

CDは、左右の円偏光に対する吸収の差を波長ごとに測る手法です。タンパク質は不斉な立体構造を持つため、この差にαヘリックスやβシートの折りたたみが反映されます。

測る波長域で見えるものが変わります。

• 遠紫外域⁠（およそ190〜250nm）：主鎖のペプチド複数のアミノ酸がペプチド結合でつながった中分子化合物で、タンパク質より鎖が短いものを指す。結合が応答し、二次構造の割合（αヘリックス／βシートの比率）を推定できます。抗体はβシートに富むため、特徴的なスペクトル形状を示します。
• 近紫外域⁠（およそ250〜320nm）：芳香族側鎖（トリプトファンなど）や、ジスルフィド結合の周辺環境が応答し、三次構造の指紋（フィンガープリント分子の部分構造の有無などを数値やビット列で表した特徴。分子どうしの類似度計算に使う。）として使えます。

CDの強みは、二次と三次を1台で押さえられることです。ただし得られるのは折りたたみの「割合」や「指紋の一致度」であり、原子レベルの構造ではありません。緩衝液溶液のpHを一定範囲に保つために使用される弱酸と共役塩基の混合溶液。の吸収が強い波長では測定が難しく、遠紫外域では低塩・低濃度の条件が求められる——これが製剤製剤。原薬を処方・充填して、最終的な投与形態に仕上げた製品。サンプルを測るときの制約になります。

示差走査熱量測定（DSC）：熱で安定性を測る

DSC試料を加熱しながら熱の出入り（DSC）や重量の変化（TGA）を測り、融点・結晶性・水分や分解の挙動を調べる装置です。詳しく →は、サンプルをゆっくり加熱しながら、折りたたみがほどける（熱変性する）ときに出入りする熱を測る手法です。折りたたみを保つのに必要なエネルギーを、直接エネルギーとして観測できる点が特徴です。

代表的な指標が熱変性中点温度加熱で変性が半分進む温度。高いほど折りたたみが熱的に安定で、製剤条件の安定性を序列づける指標に使う。（Tm）です。変性が半分進む温度を指し、高いほど折りたたみが熱的に安定していることを意味します。抗体はFab重鎖の一部と軽鎖がジスルフィドで連結した約50kDaの抗体フラグメント。2本鎖で折りたたみがやや複雑。・CH2・CH3といった複数のドメインを持つため、DSCの曲線には複数の山（複数のTm）が現れることが多く、どのドメインが弱いかを読み分けられます。

DSCの効きどころは次のとおりです。

• 製剤条件の比較⁠：pHや緩衝液・添加剤を変えたときに、Tmがどう動くかで安定性を序列化できます。Tmが高い条件ほど、保存中の変性・凝集が起きにくい傾向があります。
• 熱以外のストレスとの相関⁠：Tmは長期保存や凝集傾向の目安として使われますが、あくまで熱安定性抗体が熱に対して立体構造を保つ性質。融解温度（Tm）などで評価する。の指標です。Tmが高い＝すべてのストレスに強い、とは限らない点に注意します。

装置の違いも押さえておきます。熱の出入りを直接測るDSCに対し、蛍光の変化から見かけの融解温度熱で抗体の立体構造がほどける転移の中点にあたる温度。高いほど保存中や製造中の熱ストレスで構造が崩れにくい。を求める簡便な方式もあり、後者はハイスループットのスクリーニングに向きます。両者のTmは近い挙動を示しますが、原理が異なるため数値を直接比較するには条件をそろえる必要があります。

赤外分光（FTIR）：振動から二次構造を読む

FTIRは、分子の結合が持つ固有の振動を赤外光の吸収として捉える手法です。タンパク質では、主鎖のアミド結合に由来するアミドⅠバンドFTIRで主鎖のアミド結合に由来する赤外吸収の領域。二次構造に敏感で、αヘリックスやβシートの割合推定に使う。と呼ばれる領域が二次構造に敏感で、この帯域の形状からαヘリックス・βシート・ランダム構造の割合を推定します。

FTIRの効きどころは、CDが苦手とする条件をカバーできる点にあります。

• 高濃度サンプルに強い⁠：高濃度製剤抗体を150〜250mg/mL級まで濃くした製剤。皮下注の自己注射に向くが、粘度や凝集の課題が生じる。の抗体でも測定しやすく、希釈で構造が変わる懸念を避けられます。高濃度製剤の課題は 高濃度抗体製剤の課題 とも重なります。
• 固体・凍結乾燥製剤から水分を抜いて乾燥させ、長期安定性を高めた剤形。使用時に溶かして戻す。品を測れる⁠：凍結乾燥（フリーズドライ）した製剤の粉末を、そのまま測って折りたたみの保持を確認できます。凍結乾燥は水を取り除く過程で構造を痛めうるため、乾燥前後の二次構造の一致はしばしば重要な確認項目になります。

ただし水（H2O）はアミドⅠ領域に強い吸収を持つため、水を含む溶液を測るには重水への置換やバックグラウンド補正といった前処理・データ処理の工夫が要ります。CDとFTIRはどちらも二次構造を見ますが、原理が異なるため、片方が苦手な条件をもう片方が補う直交的な関係にあります。

3手法をどう組み合わせるか

高次構造の評価は、単独の手法で完結させるより、階層と場面に応じて組み合わせるのが実務の基本です。

製剤開発での使い方

製剤設計の流れは概ねこうです。まずDSCでTmを指標に条件を序列化し、有望な条件についてCD・FTIRで二次・三次構造が崩れていないかを確認する。Tmが高くても構造の指紋が変わっていれば、別の折りたたみに落ち着いている可能性を疑います。製剤全体の設計思想は 製剤設計の考え方 を参照してください。

比較可能性・凝集リスクでの使い方

工程変更の前後で同じ分子であることを示す比較可能性評価では、CDやFTIRの二次構造プロファイル、近紫外CDの三次構造指紋、DSCのTmを「変更前後で重なるか」で比較します。高次構造はここで、配列や糖鎖と並ぶ品質特性のひとつとして扱われます。

凝集リスクの観点では、折りたたみの安定性（Tm）が低いほど、また構造がほどけやすいほど、凝集の起点になりやすい傾向があります。ただし高次構造の手法が見るのは「溶液中で構造が保たれているか」までであり、実際に生じた凝集体そのものは別の分析で測ります。凝集体の測定手法は 凝集体分析の使い分け、µmオーダーの粒子は サブビジブル粒子 を参照してください。高次構造解析は「凝集しやすさの素地」を、凝集体分析は「実際の凝集量」を見る、という役割分担で捉えると整理しやすくなります。

なお、各手法の性能や測定範囲をベンダー名とともに語る場合、公表される数値は各社公表値（自己申告）にあたる点に留意してください。

実務の骨格をひとことでまとめると——DSCで条件を序列化し、CD・FTIRで構造の保持を確認し、比較可能性・凝集リスク評価では「変更前後で重なるか」を示す。この組み合わせが、高次構造評価の基本的な進め方です。

参考文献

• ICH Q5E, Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in Their Manufacturing Process
• ICH Q6B, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
• ICH Q8(R2), Pharmaceutical Development
• ICH Q2(R2), Validation of Analytical Procedures
• USP, 生物学的製剤の物性・高次構造評価に関する一般試験法および一般情報章, United States Pharmacopeia
• FDA, Guidance for Industry: Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics