高次構造解析とは？ CD・DSC・FTIRで立体構造を評価する
抗体医薬の品質を語るとき、アミノ酸配列（一次構造）だけでは足りません。効き目も、安定性も、凝集のしやすさも、鎖が折りたたまれてできる立体構造——二次構造・三次構造——に左右されます。この折りたたみの状態をまとめて高次構造（HOS＝Higher Order Structure）と呼びます。
高次構造は配列のように「一列に並べて読む」ことができません。そこで、分子全体の折りたたみを間接的に映す物理量を測ります。代表的なのが、円二色性（CD＝Circular Dichroism、光の左右円偏光の吸収差から二次構造を推定）、示差走査熱量測定（DSC＝Differential Scanning Calorimetry、加熱時の熱の出入りから安定性を測る）、赤外分光（FTIR＝フーリエ変換赤外分光、分子の振動から二次構造を読む）の3手法です。
本記事では、この3手法が高次構造の「どの階層」を「どんな原理」で見ているかを整理し、製剤開発・比較可能性評価・凝集リスク評価という3つの実務場面での使いどころを示します。
高次構造とは何を指すのか
タンパク質の構造は、慣習的に4つの階層で語られます。
| 階層 | 内容 | 主に見る手法 |
|---|---|---|
| 一次構造 | アミノ酸の並び順 | 質量分析・ペプチドマッピング |
| 二次構造 | αヘリックス・βシートなど局所の折りたたみ | 遠紫外CD・FTIR |
| 三次構造 | 鎖全体の立体的な折りたたみ | 近紫外CD・蛍光 |
| 四次構造 | 複数サブユニットの会合状態 | SEC・AUC など |
高次構造という言葉は、このうち二次以降——折りたたみと会合の状態を指します。一次構造が同じでも、折りたたみが崩れれば別の分子として振る舞います。抗体の抗原結合が三次・四次構造に依存する以上、高次構造は有効性と安全性に直結する品質特性です。
CD・DSC・FTIRは、高次構造を非破壊で・溶液のまま測れる点が共通しています。結晶化やタグ付けを要さず製剤に近い条件で見られるため、開発から品質管理まで幅広く使われます。
円二色性（CD）：二次構造と三次構造を光で見る
CDは、左右の円偏光に対する吸収の差を波長ごとに測る手法です。タンパク質は不斉な立体構造を持つため、この差にαヘリックスやβシートの折りたたみが反映されます。
測る波長域で見えるものが変わります。
- 遠紫外域（およそ190〜250nm）：主鎖のペプチド結合が応答し、二次構造の割合（αヘリックス／βシートの比率）を推定できます。抗体はβシートに富むため、特徴的なスペクトル形状を示します。
- 近紫外域（およそ250〜320nm）：芳香族側鎖（トリプトファンなど）や、ジスルフィド結合の周辺環境が応答し、三次構造の指紋（フィンガープリント）として使えます。
CDの効きどころは、二次と三次を1台で押さえられることです。ただし得られるのは折りたたみの「割合」や「指紋の一致度」であり、原子レベルの構造ではありません。緩衝液の吸収が強い波長では測定が難しく、遠紫外域では低塩・低濃度の条件が求められる点も、製剤サンプルを測るときの制約になります。
遠紫外CDは二次構造、近紫外CDは三次構造。同じ装置で階層を切り替えて見られるのが強みですが、緩衝液組成やタンパク質濃度に測定条件が縛られます。
示差走査熱量測定（DSC）：熱で安定性を測る
DSCは、サンプルをゆっくり加熱しながら、折りたたみがほどける（熱変性する）ときに出入りする熱を測る手法です。折りたたみを保つのに必要なエネルギーを、直接エネルギーとして観測できる点が特徴です。
得られる代表的な指標が熱変性中点温度（Tm）です。これは変性が半分進む温度で、高いほど折りたたみが熱的に安定していることを意味します。抗体はFab・CH2・CH3といった複数のドメインを持つため、DSCの曲線には複数の山（複数のTm）が現れることが多く、どのドメインが弱いかを読み分けられます。
DSCの効きどころは次のとおりです。
- 製剤条件の比較：pHや緩衝液・添加剤を変えたときに、Tmがどう動くかで安定性を序列化できます。Tmが高い条件ほど、保存中の変性・凝集が起きにくい傾向があります。
- 熱以外のストレスとの相関：Tmは長期保存や凝集傾向の目安として使われますが、あくまで熱安定性の指標です。Tmが高い＝すべてのストレスに強い、とは限らない点に注意します。
装置の違いも押さえておきます。熱の出入りを直接測るDSCに対し、蛍光の変化から見かけの融解温度を求める簡便な方式もあり、後者はハイスループットのスクリーニングに向きます。両者のTmは近い挙動を示しますが、原理が異なるため数値の直接比較には条件をそろえます。
赤外分光（FTIR）：振動から二次構造を読む
FTIRは、分子の結合が持つ固有の振動を赤外光の吸収として捉える手法です。タンパク質では、主鎖のアミド結合に由来するアミドⅠバンドと呼ばれる領域が二次構造に敏感で、この帯域の形状からαヘリックス・βシート・ランダム構造の割合を推定します。
FTIRの効きどころは、CDが苦手とする条件をカバーできる点にあります。
- 高濃度サンプルに強い：高濃度製剤の抗体でも測定しやすく、希釈で構造が変わる懸念を避けられます。高濃度製剤の課題は 高濃度抗体製剤の課題 とも重なります。
- 固体・凍結乾燥品を測れる：凍結乾燥（フリーズドライ）した製剤の粉末を、そのまま測って折りたたみの保持を確認できます。凍結乾燥は水を取り除く過程で構造を痛めうるため、乾燥前後の二次構造の一致はしばしば重要な確認項目になります。
一方で、水（H2O）はアミドⅠ領域に強い吸収を持つため、水を含む溶液を測るには重水への置換やバックグラウンド補正といった前処理・データ処理の工夫が要ります。CDとFTIRはどちらも二次構造を見ますが、原理が異なるため、片方が苦手な条件をもう片方が補う直交的な関係にあります。
3手法をどう組み合わせるか
高次構造の評価は、単独の手法で完結させるより、階層と場面で組み合わせるのが実務の基本です。
| 場面 | 主に使う手法 | 見たいこと |
|---|---|---|
| 製剤条件のスクリーニング | DSC（Tm） | どのpH・添加剤が熱的に安定か |
| 二次構造の確認 | 遠紫外CD／FTIR | 折りたたみの割合が保たれているか |
| 三次構造の確認 | 近紫外CD／蛍光 | 側鎖まわりの環境が変わっていないか |
| 高濃度・凍結乾燥品 | FTIR | 希釈せず・固体で構造を確認 |
製剤開発での使い方
製剤設計では、まずDSCでTmを指標に条件を序列化し、有望な条件についてCD・FTIRで二次・三次構造が崩れていないかを確認する流れが一般的です。Tmが高くても構造の指紋が変わっていれば、別の折りたたみに落ち着いている可能性を疑います。製剤全体の設計思想は 製剤設計の考え方 を参照してください。
比較可能性・凝集リスクでの使い方
工程変更の前後で同じ分子であることを示す比較可能性評価では、CDやFTIRの二次構造プロファイル、近紫外CDの三次構造指紋、DSCのTmを「変更前後で重なるか」で比較します。高次構造はここで、配列や糖鎖と並ぶ品質特性のひとつとして扱われます。
凝集リスクの観点では、折りたたみの安定性（Tm）が低いほど、また構造がほどけやすいほど、凝集の起点になりやすい傾向があります。ただし高次構造の手法が見るのは「溶液中で構造が保たれているか」までで、実際に生じた凝集体そのものは別の分析で測ります。凝集体の測定手法は 凝集体分析の使い分け、µmオーダーの粒子は サブビジブル粒子 を参照してください。高次構造解析は「凝集しやすさの素地」を、凝集体分析は「実際の凝集量」を見る、という役割分担で捉えると整理しやすくなります。
なお、各手法の性能や測定範囲をベンダー名とともに語る場合、公表される数値は各社公表値（自己申告）にあたる点に留意してください。
実務の骨格をひとことでまとめると、DSCで条件を序列化し、CD・FTIRで構造の保持を確認し、比較可能性・凝集リスク評価では「変更前後で重なるか」を示す、という組み合わせになります。
参考文献
- ICH Q5E, Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in Their Manufacturing Process
- ICH Q6B, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
- ICH Q8(R2), Pharmaceutical Development
- ICH Q2(R2), Validation of Analytical Procedures
- USP, 生物学的製剤の物性・高次構造評価に関する一般試験法および一般情報章, United States Pharmacopeia
- FDA, Guidance for Industry: Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics
