DSC（示差走査熱量測定）でタンパク質の熱安定性（Tm）を測る

その安定性を、加熱したときの熱の出入りから直接測るのが示差走査熱量測定（DSC＝Differential Scanning Calorimetry）です。サンプルをゆっくり昇温していくと、タンパク質はある温度で折りたたみがほどけ（熱変性し）、そのときに熱を吸収します。この吸熱の様子から、融解温度Tm（Tm＝タンパク質の半分が変性する温度）や、変性が始まる温度Tonset、変性に要した熱量（エンタルピー）といった値が得られます。

本記事では、DSCが何をどんな原理で測っているのかを整理し、抗体で複数のピークが出る理由、製剤スクリーニングや比較性評価での使い方、よく比較されるDSF（示差走査蛍光）との違い、そして「熱に強い＝長期保存でも安定」とは限らないという実務上の留意点までを順に見ていきます。高次構造そのものの評価は 高次構造解析 を、処方設計の全体像は 製剤設計 もあわせて参照してください。

DSCは何を測っているのか

DSCは、昇温にともなうタンパク質の熱変性を「吸熱ピーク」として捉え、その位置と面積から安定性を数値化する手法です。

装置の中には、サンプルを入れるセルと、緩衝液だけを入れる参照セルの2つがあります。両方を同じ速度でゆっくり温めながら、両者を同じ温度に保つのに必要な熱量の差（＝示差）を記録します。タンパク質が変性する温度帯では、折りたたみをほどくために余分な熱が必要になります。この余分な熱が、温度に対する曲線上の山、すなわち吸熱ピークとして現れます。

この曲線から読み取る代表的な指標は次の3つです。

DSCの特徴は、蛍光色素などの目印（プローブ）を加えず、熱量そのものを測る点にあります。タンパク質の折りたたみ全体を反映した、いわば直接的な物差しであり、後述するプローブ法と区別してラベルフリー（標識なし）の手法と呼ばれます。

なぜ抗体は複数のピークが出るのか

抗体（IgG）はドメインごとに安定性が異なるため、DSCでは通常、複数の熱転移が重なって観測されます。

典型的なIgG抗体は、抗原に結合するFab部分と、エフェクター機能や体内動態に関わるFc部分からなり、Fcはさらに CH2 と CH3 というドメインに分かれます。これらのドメインは折りたたみの強さがそれぞれ違うので、変性する温度も一つにそろいません。結果として、DSC曲線には複数の吸熱ピーク（あるいは肩のように重なった転移）が現れます。

一般論として、IgG1ではCH2ドメインが比較的低い温度で先に変性しやすく、Fab や CH3 はより高い温度まで折りたたみを保つ傾向が知られています。ただし、どのピークがどのドメインに対応するかは、サブクラス（IgG1/IgG2/IgG4）や分子ごとに変わります。Fab の安定性は可変領域の配列に強く影響されるため、抗体によって並び順が入れ替わることもあります。どのピークが何に由来するかは分子ごとに確認すべきで、一般則をそのまま当てはめないことが大切です。

複数ピークが出ること自体は、抗体の熱プロファイルとして自然です。実務では「一番低い温度で立ち上がる転移」が、その分子の熱的な弱点として注目されやすくなります。もっとも弱いドメインが、凝集や分解の起点になりうるためです。

製剤スクリーニングと比較性での使い方

DSCは、処方候補の順位付けと、工程変更前後の熱プロファイル一致確認という2つの場面で特に力を発揮します。

製剤スクリーニングでは、pHや緩衝液の種類、添加剤・安定化剤の組み合わせを変えたサンプルをそれぞれDSCにかけ、Tm（特に最も低い転移のTm）やTonsetを比較します。一般に、これらの温度が高い処方ほど、その条件下で折りたたみが安定に保たれていると解釈できます。多数の処方候補から見込みの薄いものを早めに落とす、いわば足切りのスクリーニングに向いています。

比較性（コンパラビリティ）評価では、製造工程を変えた前後、あるいはロット間で、DSC曲線の形——ピークの数・位置（Tm）・面積（エンタルピー）——が一致しているかを確認します。高次構造が変わっていなければ、熱プロファイルは重なります。逆にプロファイルがずれていれば、折りたたみに何らかの違いが生じたサインになります。ICH Q5E や Q6B が求める高次構造の同等性確認の一手法として、DSCはこの文脈で使われます。

いずれの場面でも、DSCは**「絶対的な合格ライン」を与える試験ではなく、条件やロットを相対比較するための道具**として位置づけるのが実務的です。Tmが何度以上なら合格、といった単一の普遍基準は存在せず、分子・剤形・投与経路によって妥当な水準は変わります。

DSF（示差走査蛍光）との違い

DSFは蛍光プローブで変性を間接的に捉える簡便法で、DSCの熱量測定とは測っている物理量が違います。

DSF（Differential Scanning Fluorimetry、Thermofluor とも呼ばれます）は、昇温にともなってタンパク質の疎水性部分が露出する（折りたたみがほどける）のを、蛍光の変化として検出する方法です。外から加える色素の蛍光を追う方式と、タンパク質自身が持つトリプトファン残基の内在蛍光を追う方式があります。少量サンプルで多検体を並行測定でき、装置も比較的手軽なため、開発初期の一次スクリーニングで広く使われます。

両者は目的が重なる部分もありますが、原理も出力も異なります。

大まかには、多数の候補や処方をふるいにかける段階ではDSFが向き、絞り込んだ後で熱量を含めた詳細な熱プロファイルを押さえたいときにDSCが向く、という使い分けになります。DSFのTmとDSCのTmは近い値になることも多いものの、測定原理が違うため、装置や検出方式をまたいで数値をそのまま比べないのが安全です。同じ手法・同じ条件の中で相対比較するのが基本です。

熱安定性と実保存安定性は別物

Tmが高いことは有望なサインですが、冷蔵での長期保存や実際の安定性を保証するものではありません。

DSCが測るのは、急速に温度を上げていったときに折りたたみがほどける温度です。一方、実際の製品が置かれるのは、たとえば2〜8℃といった低温での数か月から数年という時間軸です。この2つは、条件も、起きている現象も違います。

長期保存で問題になる劣化——凝集体の生成、脱アミド化や酸化といった化学的分解、断片化など——は、必ずしもTmの高さと一致して進むわけではありません。Tmが高くても、特定のpHや温度で脱アミド化が進みやすい分子はありますし、界面（空気や容器壁との接触面）でのストレスによる凝集は、熱変性温度とは別の要因で決まります。つまり、熱力学的な安定性（どの温度で壊れるか）と、コロイド的・化学的な保存安定性（時間をかけてどう劣化するか）は、別の軸として扱う必要があります。

したがってDSCの結果は、あくまで「熱的な折りたたみの丈夫さ」を映す一つの指標として読み、最終的な保存安定性は実時間・加速の安定性試験で確認する、という役割分担になります。処方選抜の初期に有力候補を絞る目的にはよく効きますが、それだけで長期安定性を結論づけることはできません。安定性試験や凝集リスクとの関係は 製剤設計 もあわせて参照してください。

まとめ

DSCは、昇温にともなう熱変性の吸熱ピークから、Tm・Tonset・エンタルピーを直接読み取れるラベルフリーの手法です。抗体ではFab・CH2・CH3などドメインごとに安定性が違うため複数の転移が現れ、最も低い転移がその分子の熱的な弱点として注目されます。

実務では、製剤スクリーニングでの処方順位付けと、工程変更前後・ロット間の比較性確認が主な出番です。多検体を手軽に測れるDSF（Thermofluor）とは測定原理が異なり、開発ステージに応じて使い分けます。そして最も大切な留意点は、熱安定性と実保存安定性が別の軸だということです。Tmは有望さの目安にはなっても、長期保存の安定性は安定性試験で別途確かめる——この役割分担を押さえておくと、DSCの結果を過大にも過小にも評価せずに使えます。

参考文献

• ICH Q5E, Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in Their Manufacturing Process
• ICH Q6B, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
• ICH Q8(R2), Pharmaceutical Development
• USP, 生物学的製剤の高次構造・熱安定性評価に関する一般情報, United States Pharmacopeia
• FDA, Guidance for Industry: Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics