DSC（示差走査熱量測定）でタンパク質の熱安定性（Tm）を測る

その安定性を、加熱したときの熱の出入りから直接測るのが示差走査熱量測定温度を上げながら分子がほどける際の熱の出入りを測り、融解温度（Tm）を求める手法。（DSC＝Differential Scanning Calorimetry）です。サンプルをゆっくり昇温していくと、タンパク質はある温度で折りたたみがほどけ（熱変性し）、そのときに熱を吸収します。この吸熱の様子から、融解温度Tm（タンパク質の半分が変性する温度）、変性が始まる温度Tonset変性が始まる立ち上がりの温度。製剤で「触れてはいけない温度」の目安になりやすい。、変性に要した熱量（エンタルピー）といった値が得られます。

抗体では複数のピークが現れることがあり、その読み解き方、製剤スクリーニング・比較性評価での活かし方、よく比較されるDSF（示差走査蛍光昇温による疎水部の露出を蛍光変化で捉える簡便な熱安定性評価法。多検体を並行測定できる。）との違いには、それぞれ押さえるべき勘どころがあります。見落としやすいのは、「熱に強い＝長期保存でも安定」とは限らないという点です。高次構造アミノ酸鎖が折りたたまれてできる立体構造。二次・三次構造などの階層があり、品質特性として評価する。そのものの評価は 高次構造解析 を、処方設計の全体像は 製剤設計 もあわせて参照してください。

DSCは何を測っているのか

DSC試料を加熱しながら熱の出入り（DSC）や重量の変化（TGA）を測り、融点・結晶性・水分や分解の挙動を調べる装置です。詳しく →は、昇温にともなうタンパク質の熱変性を「吸熱ピーク」として捉え、その位置と面積から安定性を数値化する手法だ。

装置の中には、サンプルを入れるセルと、緩衝液だけを入れる参照セルの2つがあります。両方を同じ速度でゆっくり温めながら、同じ温度に保つのに必要な熱量の差（＝示差）を記録します。タンパク質が変性する温度帯では、折りたたみをほどくために余分な熱が必要になる。この余分な熱が、温度に対する曲線上の山——吸熱ピーク——として現れます。

この曲線から読み取る代表的な指標は次の3つです。

DSCの最大の特徴は、蛍光色素などの目印（プローブ）を加えず、熱量そのものを測る点にあります。タンパク質の折りたたみ全体を直接反映する物差しであり、後述するプローブ法と区別してラベルフリー蛍光や酵素などの標識を付けずに、分子の結合をそのまま検出する方式。標識による活性への影響を避けられる。（標識なし）の手法と呼ばれます。

なぜ抗体は複数のピークが出るのか

抗体（IgG）はドメインごとに安定性が異なるため、DSCでは通常、複数の熱転移が重なって観測される。

典型的なIgG抗体は、抗原に結合するFab部分と、エフェクター機能抗体が免疫系を動かして標的細胞を排除する働き。ADCCやCDCなどがある。や体内動態に関わるFc部分からなり、Fcはさらに CH2 と CH3 というドメインに分かれます。これらのドメインは折りたたみの強さがそれぞれ異なるため、変性する温度も一つにそろいません。結果として、DSC曲線には複数の吸熱ピーク（あるいは肩のように重なった転移）が現れます。

一般論として、IgG1ではCH2ドメインが比較的低い温度で先に変性しやすく、Fab や CH3 はより高い温度まで折りたたみを保つ傾向が知られています。ただし、どのピークがどのドメインに対応するかは、サブクラスヒトIgGのIgG1〜IgG4という分類。エフェクター機能や補体活性化の強弱がそれぞれ異なる。（IgG1/IgG2/IgG4）や分子ごとに変わります。Fab の安定性は可変領域抗体の抗原を認識する先端部分。CDRとフレームワーク領域からなり、標的にフィットするかで結合が決まる。の配列に強く影響されるため、抗体によって並び順が入れ替わることもある。⁠どのピークが何に由来するかは分子ごとに確認すべきで、一般則をそのまま当てはめないことが大切です。

複数ピークが出ること自体は、抗体の熱プロファイルとして自然です。実務上、「一番低い温度で立ち上がる転移」がその分子の熱的な弱点として注目されやすい。もっとも弱いドメインが、凝集や分解の起点になりうるためです。

製剤スクリーニングと比較性での使い方

DSCが特に力を発揮するのは、処方候補の順位付けと、工程変更前後の熱プロファイル一致確認という2つの場面です。

製剤スクリーニングでは、pHや緩衝液の種類、添加剤・安定化剤有効成分そのもの以外に製剤へ加え、安定性や溶解性を保つために用いる添加物の総称です。詳しく →の組み合わせを変えたサンプルをそれぞれDSCにかけ、Tm（特に最も低い転移のTm）やTonsetを比較します。これらの温度が高い処方ほど、その条件下で折りたたみが安定に保たれていると解釈できます。多数の処方候補から見込みの薄いものを早めに落とす、いわば足切りのスクリーニングに向いた手法です。

比較性（コンパラビリティ製法変更や拠点変更の前後で製品の品質が同等であることを立証すること。ICH Q5Eが枠組み。）評価では、製造工程を変えた前後、あるいはロット間で、DSC曲線の形——ピークの数・位置（Tm）・面積（エンタルピー）——が一致しているかを確認します。高次構造が変わっていなければ熱プロファイルは重なり、逆にプロファイルがずれていれば折りたたみに何らかの違いが生じたサインになります。ICH Q5E製造工程の変更前後で製品が同等・比較可能かを評価する考え方を定めたガイドライン。 や Q6B が求める高次構造の同等性変更前後が完全に同一でなくても、品質・安全性・有効性で高い類似性を保ち差異が悪影響しないと言える状態。確認の一手法として、DSCはこの文脈で使われます。

いずれの場面でも、DSCは⁠「絶対的な合格ライン」を与える試験ではなく、条件やロットを相対比較するための道具として位置づけるのが実務的です。Tmが何度以上なら合格、といった単一の普遍基準は存在しない。分子・剤形・投与経路によって妥当な水準は変わります。

DSF（示差走査蛍光）との違い

DSF分子がほどけるのに伴う蛍光の変化を追って融解温度を求める手法。少量・多検体で回しやすい。は蛍光プローブで変性を間接的に捉える簡便法であり、DSCの熱量測定とは測っている物理量が根本的に異なります。

DSF（Differential Scanning Fluorimetry昇温による疎水部の露出を蛍光変化で捉える簡便な熱安定性評価法。多検体を並行測定できる。、Thermofluor昇温による疎水部の露出を蛍光変化で捉える簡便な熱安定性評価法。多検体を並行測定できる。 とも呼ばれます）は、昇温にともなってタンパク質の疎水性分子が水と親和せず、油脂や非極性溶媒と相互作用しやすい性質で、二本鎖RNAと一本鎖RNAではその程度が異なり分離の指標となる。部分が露出する（折りたたみがほどける）のを、蛍光の変化として検出する方法です。外から加える色素の蛍光を追う方式と、タンパク質自身が持つトリプトファン残基の内在蛍光を追う方式があります。少量サンプルで多検体を並行測定でき、装置も比較的手軽なため、開発初期の一次スクリーニングで広く使われています。

両者は目的が重なる部分もありますが、原理も出力も異なります。

大まかな使い分けとしては、多数の候補や処方をふるいにかける段階ではDSFが向き、絞り込んだ後で熱量を含めた詳細な熱プロファイルを押さえたいときにDSCが向きます。⁠DSFのTmとDSCのTmは近い値になることも多いものの、測定原理が違うため、装置や検出方式をまたいで数値をそのまま比べないのが安全です。相対比較は同じ手法・同じ条件の中で行うことが基本です。

熱安定性と実保存安定性は別物

Tmが高いことは有望なサインです。ただし、冷蔵での長期保存や実際の安定性を保証するものではありません。

DSCが測るのは、急速に温度を上げていったときに折りたたみがほどける温度です。一方、実際の製品が置かれるのは、たとえば2〜8℃といった低温での数か月から数年という時間軸です。条件も、起きている現象も、まったく別の話になります。

長期保存で問題になる劣化——凝集体の生成、脱アミド化アスパラギンなどが変化して電荷が変わる化学的分解。特定の隣接配列で起きやすい。や酸化といった化学的分解、断片化主鎖が切れて分子が分かれる劣化。低分子量体（LMW）として現れ、酸性側などで進みやすい。など——は、必ずしもTmの高さと一致して進むわけではありません。Tmが高くても、特定のpHや温度で脱アミド化が進みやすい分子はありますし、界面（空気や容器壁との接触面）でのストレスによる凝集は熱変性温度とは別の要因で決まります。つまり、⁠熱力学的な安定性（どの温度で壊れるか）と、コロイド的・化学的な保存安定性（時間をかけてどう劣化するか）は、別の軸として扱う必要があります。

したがってDSCの結果は、「熱的な折りたたみの丈夫さ」を映す一つの指標として読み、最終的な保存安定性は実時間・加速の安定性試験出荷時から有効期限まで品質特性が規格内にとどまることを確認する試験。で確認する——この役割分担が基本です。処方選抜の初期に有力候補を絞る目的にはよく効きますが、それだけで長期安定性を結論づけることはできません。安定性試験や凝集リスクとの関係は 製剤設計 もあわせて参照してください。

まとめ

DSCは、昇温にともなう熱変性の吸熱ピークから、Tm・Tonset・エンタルピーを直接読み取れるラベルフリーの手法です。抗体ではFab重鎖の一部と軽鎖がジスルフィドで連結した約50kDaの抗体フラグメント。2本鎖で折りたたみがやや複雑。・CH2・CH3などドメインごとに安定性が違うため複数の転移が現れ、最も低い転移がその分子の熱的な弱点として注目されます。

実務での主な出番は、製剤スクリーニングでの処方順位付けと、工程変更前後・ロット間の比較性確認の2つです。多検体を手軽に測れるDSF（Thermofluor）とは測定原理が異なり、開発ステージに応じて使い分けます。そして最も大切な留意点は、熱安定性と実保存安定性が別の軸だということ。Tmは有望さの目安にはなっても、長期保存の安定性は安定性試験で別途確かめる——この役割分担を押さえておくと、DSCの結果を過大にも過小にも評価せずに使えます。

参考文献

• ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。 Q5E, Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in Their Manufacturing Process
• ICH Q6B, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
• ICH Q8(R2), Pharmaceutical Development
• USP, 生物学的製剤の高次構造・熱安定性評価に関する一般情報, United States Pharmacopeia
• FDA, Guidance for Industry: Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics