SEC-MALSとは？絶対分子量と凝集を光散乱で測る

この弱点を補うのがMALS（多角度光散乱、Multi-Angle Light Scattering）です。MALSは溶出してくる各成分がどれだけ光を散乱するかを複数の角度で測り、そこから絶対分子量（標準品に頼らず求める真の分子量）と慣性半径（分子の広がりの指標）を直接算出します。この二つを組み合わせたのがSEC-MALSSECに多角度光散乱検出を組み合わせ、溶出した成分の絶対分子量を測る手法。凝集体などの評価に使う。です。カラムの溶出時間に較正曲線を当てはめる必要がないため、「このピークはモノマー製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →か、二量体同種の分子が2つ結合した会合体で、インスリンが六量体から解離する際に経る中間的な状態。か、それより大きいのか」を分子量そのもので判定できます。

SEC-MALSの肝は、溶出位置ではなく散乱光から分子量を読む点にあります。そこには屈折率検出とdn/dc（濃度あたりの屈折率変化）が欠かせません。凝集体タンパク質分子どうしが結合してできた高分子量の集合体です。有効性や免疫原性に影響するため、その含量を測ります。詳しく →評価の手法選定は 凝集体をどの分析で見るか、立体構造の評価は 高次構造解析とは？ もあわせて参照してください。

SEC単独の分子量は「相対値」である

SEC分子を天然に近い条件でサイズにより分ける液体クロマトグラフィー。凝集体の主要な定量法。で表示される分子量は標準品との比較にもとづく推定であり、対象分子の形が標準品と違えば実際とずれます。

SECは、細孔をもつ充填処方済みの溶液をバイアルやシリンジなどの容器へ無菌的に充填し、封止する製造工程。剤のカラムに分子を通し、大きい分子ほど細孔に入り込めず早く溶出する原理でサイズ分離します。ここで「サイズ」として効いているのは、分子量そのものではない。溶液中で分子が占める見かけの大きさ——流体力学的サイズ（hydrodynamic size、溶媒をまとった状態での分子の広がり）です。

分子量を求めるには、あらかじめ分子量が分かった標準タンパク質を流し、溶出時間と分子量の関係（較正曲線）を作っておきます。未知試料の溶出時間をこの曲線に当てはめて分子量を読む、という手順です。

問題は、この換算が「対象分子と標準品が同じ形をしている」という前提に立っている点です。抗体はY字型で、球状タンパク質の標準品より同じ分子量でも広がっています。伸びた分子や糖鎖タンパク質に付加される糖の鎖状構造で、抗体の有効性・免疫原性などに影響する重要な品質特性。の多い分子も同様。形が違えば同じ分子量でも溶出時間がずれ、較正から読んだ分子量は真の値から外れます。

つまりSEC単独は「モノマーに対してHMW（高分子量体）モノマーが会合してできた凝集体。免疫原性のリスク因子で、SECで経時的に追跡する。が何%あるか」を面積で追う用途には十分です。ただし「そのピークが正確に何量体か」を分子量で言い切るには向かない。そこを埋めるのがMALSです。

MALSはなぜ較正なしで絶対分子量を出せるのか

光散乱の強度は分子量と濃度の積に比例するため、濃度が分かれば散乱強度から分子量を直接計算できます。

溶液中の分子に光を当てると、分子は光を散乱します。この散乱光の強さは、大まかに言えば「分子量 × 濃度」に比例します。同じ濃度なら大きい分子ほど強く散乱する——だから散乱強度は分子量を映す物理量になります。標準品の溶出時間に頼らず、光と分子の相互作用という物理から分子量が出るので「絶対」分子量と呼ばれます。

ただし散乱強度は分子量と濃度の「積」に比例するので、分子量を切り出すには濃度が別途必要です。そこで後述の屈折率検出などで各溶出点の濃度を測り、散乱強度を濃度で割ることで分子量を取り出します。

「多角度」である理由は、分子の広がりを見るためです。分子が光の波長に対して十分小さければ、どの角度でも散乱強度は同じです。しかし分子が大きくなると、分子内の各部分から出た散乱光が干渉し、角度によって強度が変わります。この角度依存性の傾きから慣性半径（Rg、分子の質量分布の広がり）が求まります。複数角度で測り、角度ゼロへ外挿した強度が真の分子量に対応し、傾きが慣性半径に対応する、という関係です。

角度ゼロへ外挿した強度から分子量を、角度依存性の傾きから慣性半径を得る——この二つが同時に取れるのがMALSの強みです。慣性半径は、抗体モノマーのように光の波長に対して十分小さい分子では小さすぎて精度が出にくいこともありますが、大きな凝集体では形状情報として有用になります。

屈折率検出とdn/dcが要になる

濃度を測る検出器と、その較正定数であるdn/dcの正確さが、絶対分子量の確からしさを左右します。

前章のとおり、分子量を出すには各溶出点の濃度が要ります。この濃度測定に多く使われるのが示差屈折率検出器（RI、Refractive Index detector）です。タンパク質が溶けると溶液の屈折率がわずかに上がり、その変化量が濃度に比例します。この比例定数がdn/dc（濃度あたりの屈折率変化、単位はmL/g）です。

dn/dcは分子ごとに決まる値で、多くの標準的なタンパク質ではおよそ0.185 mL/g前後が一つの目安として使われます。ただし糖鎖の多い糖タンパク質や、界面活性剤タンパク質の凝集や容器壁への吸着を防ぐため製剤へ少量加える添加剤で、細胞培養で細胞を保護する目的でも使われます。詳しく →・脂質と複合体を作る膜タンパク質などでは、この値が変わります。dn/dcがずれると濃度がずれ、その分だけ分子量もずれます。分子量はdn/dcにほぼ反比例する形で効くため、この値の妥当性は結果の信頼性に直結します。

濃度検出にはUV吸光（280 nm）を使う構成もあります。この場合は吸光係数物質が特定波長の光をどれだけ吸うかを表す係数。A280からタンパク質濃度を計算する際に分子ごとの値を用いる。（extinction coefficient、濃度と吸光度を結ぶ係数）が濃度換算の定数になります。抗体のように吸光係数がよく分かっている分子ではUVも実用的ですが、発色団を持たない糖鎖部分は280 nmでほとんど吸収しないため、糖鎖の寄与を含めて質量を見たい場合はRIのほうが素直なことがあります。

複合体（たとえばタンパク質と糖鎖、あるいは膜タンパク質と界面活性剤）では、RIとUVの両方を使って各成分の寄与を分けて解析する手法もあります。いずれにせよ、MALSの分子量は「散乱・濃度・dn/dc（または吸光係数）」の三点セットで初めて確定します。この理解が実務では大切です。

モノマー・二量体・オリゴマーをどう同定するか

SEC-MALSは各ピークに絶対分子量を紐づけられるので、面積だけでなく「何量体か」を分子量で確認できます。

抗体モノマーの分子量はおおむね150 kDa分子の質量を表す単位。水素原子1個ぶんの重さをおおよそ1とし、抗体は約15万ダルトンの大きな分子。前後です。SEC-MALSでは、メインピークの分子量がこの値に合致するかをまず確認し、続いてHMW側のピークがモノマーの整数倍（約300 kDaなら二量体、それ以上ならより高次のオリゴマー）に対応するかを見ます。標準品較正では「二量体らしい位置に出ている」までしか言えませんが、絶対分子量が取れれば「実測でおよそ二量体分の質量がある」と一歩踏み込めます。

もう一つの利点が、ピーク内の分子量の均一性を見られる点です。溶出ピークの各時点で分子量を算出できるので、ピーク全体でほぼ一定なら単一種、頭からお尻へ分子量が連続的に変化するなら分子量分布をもった集団や部分的な会合・解離薬分子が水溶液中で電荷を帯びたイオン型と電荷を持たない非イオン型に分かれる現象で、体内のpH環境によって割合が変化する。を疑う、といった読み方ができます。SEC単独のクロマトグラム（吸光の山だけ）では、この内部の均一性は見えません。

ただし前提として、そもそもSECのカラムでピークが分離できていることが必要です。分離が不十分でモノマーと二量体が重なっていれば、MALSはその重なった領域の平均的な分子量を返します。MALSは分離を良くする道具ではなく、分離できた成分の質量を正しく測る道具だと押さえておくとよいです。慣性半径は前述のとおり抗体モノマー単体では小さくて精度が出にくいことが多く、オリゴマーや大きな凝集体で形状情報として活きます。

SEC-MALSでも避けきれないSEC由来の限界

MALSは分子量測定の精度を上げますが、SEC本体に起因する希釈解離・カラム相互作用・非特異吸着といった問題はそのまま残ります。

SEC-MALSはあくまでSECの後段にMALSを付けた構成です。したがって、分子量の求め方は改善されても、サンプルがカラムを通る過程で起きる次のような現象は避けられません。

• 希釈解離⁠：SECは移動相でサンプルを希釈しながらカラムに通します。高濃度製剤抗体を150〜250mg/mL級まで濃くした製剤。皮下注の自己注射に向くが、粘度や凝集の課題が生じる。中で成立している可逆的な会合は、希釈で解離して見えなくなることがあります。これはMALSを付けても解消しません。溶液中そのままの状態を見たいなら、希釈を伴わない DLS（動的光散乱） やAUC（分析超遠心）高速回転で試料を沈降させ、沈降係数の違いから分子種を分離・定量する手法。SEC結果の直交確認に使う。などの直交法異なる原理の手法で同じ対象を測り、結果を突き合わせて検証し合う分析の組み方。（原理の異なる別法）が要ります。
• カラム相互作用・非特異吸着⁠：固定相とサンプルの非特異的な相互作用で、HMWが吸着して回収率が下がる、ピークが歪む、といったことが起きます。吸着で失われた成分はそもそも検出されないため、真の凝集量を過小評価する恐れがあります。移動相クロマトグラフィーにおいて試料を運ぶ液体（または気体）で、組成や流量が分離性能に大きく影響する。の塩濃度やpHで挙動が動く点も同じです。
• 移動相条件への感度⁠：分離も、非特異相互作用も、移動相のイオン強度溶液中のイオンの量の指標。塩を加えると静電的な引力を覆い隠し、粘度を下げられることがある。やpHに影響されます。条件を変えると同じ試料でも見え方が変わるため、比較する際は条件をそろえる必要があります。

これらはSECという分離手法そのものの性質であり、検出器を変えても消えません。だからこそ凝集体評価は、SEC（-MALS）を主力にしつつ、希釈を伴わない手法や共有結合性HMWジスルフィド架橋などで共有結合的に固定された高分子量体。変性させても解けない凝集体。を見る手法を組み合わせる直交原理（物差しの向き）の異なる手法を重ねて品質を評価する考え方。単一手法の死角を減らす。アプローチが基本になります。手法ごとの守備範囲は 凝集体をどの分析で見るか に整理しています。分子量ではなく折りたたみ状態（高次構造アミノ酸鎖が折りたたまれてできる立体構造。二次・三次構造などの階層があり、品質特性として評価する。）が知りたい場面では 高次構造解析 が対象になります。品質特性としての凝集体の扱いは、ICH Q6BやICH Q5E製造工程の変更前後で製品が同等・比較可能かを評価する考え方を定めたガイドライン。などのガイドラインが背景にあります。

まとめ

SEC単独で得られる分子量は、標準品との溶出時間比較にもとづく相対値です。抗体のように標準品と形が違う分子では、この推定は外れることがあります。SEC-MALSは、溶出してくる各成分の散乱光を多角度で測り、「散乱強度 ∝ 分子量 × 濃度」という物理から絶対分子量を、角度依存性から慣性半径を、較正なしで直接求めます。これにより、HMWピークがモノマーの何倍の質量か、ピーク内の分子量が均一かまで踏み込んで評価できます。

一方で、分子量測定には濃度が不可欠で、屈折率検出とdn/dc（またはUVと吸光係数）の妥当性が結果の信頼性を左右します。そしてMALSを付けても、希釈解離・カラム相互作用・非特異吸着といったSEC本体の限界は残ります。SEC-MALSは「分離できた成分を正しく測る」道具であり、分離や溶液そのままの状態を保証する道具ではありません。凝集体を確からしく捉えるには、希釈を伴わない手法などと組み合わせる直交評価が前提になります。

参考文献

• ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological / Biological Products
• ICH Q5E: Comparability of Biotechnological / Biological Products Subject to Changes in Their Manufacturing Process
• USP <129>: Analytical Procedures for Recombinant Therapeutic Monoclonal Antibodies（USP）
• Some, D. et al. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (2019), doi:10.3791/59615
• EMA: Guideline on development, production, characterisation and specification for monoclonal antibodies and related products