ライブセルイメージングとは？殺さずに、時間の経過ごと観察する

終点だけを見ると、経過が消える

細胞に何かを加えた効果を調べるとき、多くの測定は終点（エンドポイント）⁠を見ます。48時間後に生きている細胞が何個か、蛍光がどれだけ出たか。手軽で定量しやすい反面、そこに至るまでの経過は失われます。

同じ「48時間後に細胞数が半分」という結果でも、中身は違いえます。

• 加えた直後に一気に死んで、その後は生き残りが増えていた
• 最初は何も起きず、36時間を過ぎてから死に始めた
• 死んではおらず、分裂が止まっただけだった

3つは意味がまったく違いますが、終点の数字は同じです。⁠ライブセルイメージング生きたままの細胞を経時的に顕微鏡で撮影し、増殖・動き・形態の変化を観察する手法です。細胞を殺さずに動的な挙動を追えます。詳しく →⁠（live cell imaging）は、この経過を取り戻すために、生きた細胞を培養条件のまま一定間隔で撮り続けます。

装置の2つの形

構成は大きく2種類に分かれ、向く用途が違います。

インキュベータ内蔵型（インキュベータ組込み型）⁠は、装置ごと培養器の中に置くか、装置自体が培養環境を持ちます。温度・CO₂・湿度が安定した状態で、プレートを何枚も自動で撮り続けられます。細胞は動かさないので環境の乱れが小さく、⁠数日から数週間の長い観察や、多検体の並列観察に向きます。位相差での観察が中心で、コンフルエンシー培養容器の底面積に対して細胞が覆っている面積の割合を示す指標で、細胞の増殖状態や感染実験の条件を管理するために用いる。（培養面の被覆率）や細胞数の推移を自動で数値化する使い方が定番です。

顕微鏡設置型（ステージトップ型）⁠は、通常の顕微鏡に温度・CO₂を制御する小型のチャンバーを載せます。高倍率・高解像度の光学系と共焦点などの機能をそのまま使えるので、⁠個々の細胞の中で起きる現象を細かく見る用途に向きます。細胞内小器官の動き、タンパク質の局在変化、分裂の様子といった対象です。

「たくさんの細胞を長く、粗く」見るのか、「少数の細胞を短く、細かく」見るのか。この軸で選ぶと迷いません。

壁その1：光毒性

生きた細胞に光を当てて観察する以上、⁠光そのものが細胞にダメージを与えます⁠。これを光毒性光を吸収した薬剤が皮膚や眼で組織を傷つける、免疫を介さない毒性。光線過敏症のうち免疫が関与しない型を指す。（phototoxicity）と呼びます。

蛍光観察では特に問題になります。励起光が蛍光色素を励起するとき、周囲に活性酸素が生じ、細胞を傷つけます。強い光を短時間当てても、弱い光を長時間当てても蓄積します。結果として、⁠観察していること自体が測定対象を変えてしまうという状況が起こります。増殖が遅く見えたのは薬剤のせいではなく、撮影のせいだった、という誤りが典型です。

抑え方は次のとおりです。

• 位相差など、光を当てない観察を主軸にする⁠：形態と増殖を見るだけなら蛍光は要りません。長期観察で位相差が好まれるのはこのためです。
• 撮影間隔を空ける⁠：知りたい現象の時間スケールに対して、必要以上に細かく撮らない。
• 露光時間と光量を下げる⁠：感度の高いカメラを使い、光を減らす方向で条件を出す。
• 無照射の対照を置く⁠：同じ条件で撮影しないウェルを用意し、終点で比較すれば影響量がわかります。

壁その2：焦点ずれ

数日にわたって撮り続けると、途中でピントが外れます。原因は温度変化による部材のわずかな伸縮、培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。の蒸発による液面変化、装置の振動などです。1枚ずつ見れば些細でも、⁠時系列の途中でぼやけた区間があると、その区間の解析結果が使えません⁠。

対策として、多くの装置は撮影のたびに焦点を合わせ直す仕組みを持ちます。加えて実務では、蒸発を抑える（外周ウェルを使わない、蒸発防止のプレートを使う）、装置の温度を安定させてから開始する、といった準備が効きます。

何を数値にするか

撮った画像は、そのままでは判断材料になりません。画像解析で数値に落とします。よく使う指標は次のとおりです。

• コンフルエンシー⁠：培養面のうち細胞が覆う割合。ラベルなしで測れるので、増殖曲線の代用として広く使われます。
• 細胞数⁠：個々の細胞を検出して数える。塊になりやすい細胞では難しくなります。
• 形態パラメータ⁠：面積、円形度粒子がどれだけ真円に近いかを表す指標。真円の液滴といびつなタンパク質凝集を見分けるのに使う。、アスペクト比。伸展や丸化を数値で捉えます。丸くなって浮くのは細胞死の初期兆候であることが多いため、死の検出にも使えます。
• 遊走の軌跡⁠：個々の細胞を追跡し、速度と方向性を出します。創傷治癒アッセイなどで使われます。

コンフルエンシーは扱いやすい一方、注意も要ります。⁠細胞が重なって増える系では、面積が飽和しても細胞数は増え続けます⁠。単層で増える細胞に向いた指標であり、細胞数と生存率の直接測定と併用して確かめるのが安全です。

どこで効くか

実務で価値が出るのは、経過の情報が判断を変える場面です。

• 増殖抑制と細胞死の区別⁠：終点の細胞数が同じでも、分裂が止まったのか死んだのかで意味が違います。経時的に見れば分かれます。
• 効き始めのタイミング⁠：作用が早いか遅いかは、作用機序薬が効果を発揮する仕組み。抗体医薬ではADCCやCDCなどが該当し、アッセイで裏づける。を推定する手がかりになります。
• 細胞株の構築での挙動確認⁠：クローンごとの増殖の立ち上がりや形態の均一性を、播種から追って比較できます。
• 少数派の挙動⁠：全体の平均では消えてしまう、一部の細胞だけが示す反応を拾えます。

一方で、⁠大量の検体を短時間で処理したいスクリーニングには向きません⁠。1検体あたりの撮影と解析に時間がかかるためです。まず終点測定で候補を絞り、残った候補の挙動をライブセルイメージングで詳しく見る、という順序が現実的です。

まとめ

• ライブセルイメージング＝生きた細胞を培養条件のまま連続撮影し、変化を時間軸で捉える手法。
• インキュベータ内蔵型は多検体・長期・粗く、顕微鏡設置型は少数・短期・細かく。用途で使い分ける。
• 光毒性は観察が対象を変えてしまう問題。位相差を主軸にし、間隔と光量を抑え、無照射の対照で影響量を確かめる。
• コンフルエンシーは扱いやすいが、重なって増える細胞では飽和する。直接の細胞数測定と併用する。

参考文献

• 日本薬局方 参考情報「細胞加工製品の品質管理遺伝子治療製品の品質・安全性・有効性を保証するために製造・出荷の各段階で実施する試験・管理の総体。」（厚生労働省）