論理ゲート型CARとは？2つの抗原で正常細胞を避ける設計

2010年、HER2を狙うCAR-T患者や健常ドナーのT細胞にCAR（キメラ抗原受容体）を導入し、がん細胞を攻撃させる細胞治療。詳しく →を、肺と肝臓に転移した大腸がんの患者に投与したところ、患者は5日後に亡くなりました。HER2はがん細胞に多い目印ですが、肺の上皮にもごく少量あります。投与した細胞が肺に集まり、その少量のHER2に反応したと、報告した研究者は考えています。

がんの目印が正常な組織にもある。これが固形がんのCAR-Tの、いちばん根本的な悩みです。CD19のように、正常なB細胞ごと失っても何とかなる標的は例外で、固形がんで狙いたい抗原の多くは、量の差こそあれ正常組織にも出ています。その答えの一つが論理ゲート型CAR特定の抗原を認識するよう設計し、細胞に導入して指向性を与える人工の受容体。詳しく →で、1つの抗原で判定する代わりに、2つの抗原の組み合わせで「攻撃してよい細胞」を決めます。

開発なら漏れの管理、製造なら導入できる遺伝子の長さ、品質保証なら試験の種類の増加と、役割ごとに向き合う場所が違います。

単一抗原の限界 ― 感度を上げるほど、正常組織に近づく

2010年の症例（Morgan ら）では、抗体のトラスツズマブをもとにしたCARを使い、約100億個の細胞が投与されました。患者は投与から15分以内に呼吸困難を起こし、サイトカイン細胞が放出する免疫の情報伝達物質。細胞治療では効果と安全性のリードアウトになる。詳しく →が大量に放出された状態で亡くなっています。

厄介なのは、効き目と副作用が同じつまみで動くことです。CARの親和性抗体が抗原に結合する強さ。解離定数などで表し、値が小さいほど強く結合することを示す。詳しく →（抗原への結合の強さ）を上げれば、少ない抗原にも反応して効きが良くなりますが、正常組織の少量の抗原にも同じだけ反応します。

どれくらいの量で反応が始まるのかは、実測されています。CD20を標的にしたCARでは、標的の細胞1個あたり200分子ほどで殺傷が成立しました。サイトカインの産生と増殖には、その25倍にあたる5,000分子前後が必要でした（Watanabe ら、2015）。殺す側の閾値のほうがずっと低いので、正常組織の少量の抗原でも、殺傷は起こりうるということです。この結果は、エフェクター細胞と標的細胞の比を10対1にした試験で得られたもので、体内の比は別の問題です。

抗原1つで見分けようとする限り、がんと正常組織の線は引き直せません。

2つの抗原で判定する ― AND と NOT

判定に使う情報を増やすのが、論理ゲートの考え方です。

ANDは、抗原Aと抗原Bの両方があるときだけ攻撃します。代表的な作り方が、人工の受容体synNotchを使う回路です。synNotchは抗原Aを認識すると、細胞内の断片が切り離されて核へ移り、抗原B用のCARの遺伝子を働かせます。抗原Aだけの細胞にはCARの標的がなく、抗原Bだけの細胞にはCARがまだ出ていないので、両方がそろったときにだけ攻撃が成立します（Roybal ら、2016）。全身を巡る間はCARを持たず、標的の近くに来て初めて武装するのが特徴です。細胞内のシグナルを2つに割る作り方もあります。片方の抗原でCD3ζの信号を、もう片方の抗原で共刺激の信号を入れ、どちらか一方だけでは十分に活性化T細胞を抗原刺激や人工的な刺激試薬で活性化し、増殖・機能発揮できる状態に誘導する操作。詳しく →しないようにします（Kloss ら、2013）。

NOTは、ある抗原があるときは攻撃しない、というブレーキです。正常な細胞にあって、がんでは失われている目印をブレーキに使います。A2 Bio の A2B530 は、CEAを認識して活性化するCARに、HLA-A02を認識して働きを止める受容体を組み合わせた細胞です。対象は、腫瘍がHLA-A02の片方を失っている（HLA細胞表面にあり自己と非自己を見分けるヒトの主要な組織適合抗原。他家では不一致が拒絶の原因になる。詳しく → LOH）患者に限られ、事前の検査で選びます。EVEREST-1試験（NCT05736731）が実施され、2024年11月の学会（SITC）で初期の安全性データが報告されました。論理ゲートは、論文の中の設計から臨床試験に入った段階にあります。

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ANDは「両方あるときだけ」、NOTは「この目印があるときは止める」です。どちらも、判定に使う目印を増やして線を引き直します。

漏れ ― ANDがORに近づく

実装でいちばん問題になるのが、基底発現目的タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で転写・翻訳させ、機能的なタンパク質として産生させる工程。詳しく →です。

スイッチが切れているはずの状態でも、CARがわずかに出てしまうことがあります。漏れ（leakiness）と呼ばれます。わずかでも出ていれば、抗原Bを持つだけの正常細胞を攻撃しえます。ANDがORに近づくということです。

厄介なのは、CARの効き目を高めるほど、少ない発現量細胞が目的のタンパク質を作る量。低いと必要量の確保に手間がかかり、製造コストが上がる。詳しく →でも殺傷が成立して、漏れが効いてくる点です。特異性分析法において、共存する不純物・分解物・添加剤などが存在しても目的成分だけを正確に測定できる能力。詳しく →を上げる設計と、効き目を上げる設計が、ここで正面からぶつかります。対処は、転写の段階で抑えるか、出てしまったCARを分解して減らすかの二方向で、分解する配列を付ける方法が試されています。

導入するベクターのコピー数が増えれば、基底発現も増えると考えられます。VCNは安全性の指標であると同時に、特異性にも関わる値です。

漏れは、回路の図面だけでは決まりません。誘導前の状態で、抗原Bだけの細胞を殺さないかを、実際に測って確かめます。

種類ではなく量で分ける ― 親和性を下げる

回路を組まずに済む別の解き方もあります。

がん細胞は正常細胞より抗原の密度が高いことが多いので、一定量を超えたときだけ働くように、CARの親和性をあえて下げます。2015年の Liu らの報告では、ErbB2やEGFRを標的にして、親和性が3桁にわたって違うCARの一群を作りました。親和性を下げたCARは、抗原を多く持つ腫瘍を排除する力は保ち、正常組織と同程度の少量の抗原しか持たない細胞は残しました。培養細胞とマウスでの結果です。

抗原が正常組織と共通でも、密度の差で線を引ける場合があります。向くのは、標的の密度に、がんと正常組織の差が十分にあるときです。差が小さい標的や、がんの中で抗原の量がばらつく標的では、量の線だけでは引けません。

この方法は、測れなければ始まりません。細胞あたりの抗原の数は、定量用のビーズを使ったフローサイトメトリー細胞を一つずつ測定し、表面マーカーや性質を調べる手法です。細胞の種類・純度・活性の確認に使います。詳しく →で求めるのが一般的です。正常組織側の値まで押さえて、初めて閾値を置けます。

論理ゲートが「種類で分ける」なら、親和性の調整は「量で分ける」です。どちらを採るかは、標的の性質で決まります。

製造と品質管理 ― 増えるのは試験

回路が複雑になると、まず物理的な長さの制約にぶつかります。

synNotchとCARの両方を載せると遺伝子が長くなり、レンチウイルスベクターに入る長さの目安である8〜9 kbほどに収まるかどうかが、現実の壁です。2本のベクターに分ければ収まりますが、今度は両方が入った細胞の割合を規格にする必要があります。

培養の工程は、単一抗原のCAR-Tと大きくは変わりません。増えるのは試験です。重要品質特性には、CARの発現量の総量に加えて、誘導の前後の比が入ります。力価試験は、1種類の標的細胞に対する殺傷では足りません。ANDが設計どおりに働くことを示すには、抗原Aだけ、Bだけ、両方、どちらもなしの4種類の標的細胞を用意して比べます。標的の細胞株を4系統そろえられるかが、開発の速さを左右します（殺傷の測り方は細胞傷害性アッセイで解説しています）。

ロット間の比較では、漏れの程度がそろっているかを見ます。回路を載せた細胞は、増える力や体内で続く力で不利になることがあり、自家か他家かによっても、許容できる複雑さが変わります。

設計の自由度が上がったぶんは、規格で押さえる軸の数として返ってきます。

明日から確かめられること ― 回路を足す前に

開発、製造、品質保証のどの立場でも、使える確認項目です。

• 狙う抗原が、正常組織のどこに、どれくらいの量であるか。実測か、文献か
• 密度の差だけで分けられないかを、回路を組む前に検討したか
• 組み合わせる第二の抗原は、がんの側だけにあると言えるか
• 回路の遺伝子の長さが、ベクターに収まるか。2本に分けるなら、共導入率を規格にしているか
• 漏れの測り方が決まっているか。誘導前後のCAR発現の比と、抗原Bだけの細胞への殺傷の両方を見ているか
• 力価試験細胞や生体分子に実際に作用させ、医薬品の生物活性（どれだけ効くか）を数値化する試験。詳しく →に使う標的細胞を、4系統そろえられるか
• 回路を載せた細胞が、増えて、体内で続くかを見ているか

営業の立場なら、顧客のCARが単一抗原か回路型かを最初に聞くと、必要な標的細胞と試薬、試験の範囲が見えます。抗原の量を測る装置はフローサイトメーター、ベクターのコピー数の測定はデジタルPCRの製品ページで比べられます。装置の選び方はフローサイトメーターの選び方で読めます。

次の疑問に応える記事も用意しています。CAR-Tの製造全体はCAR-T細胞療法の製造工程、遺伝子編集標的遺伝子を狙って書き換える技術。他家細胞治療で重みを増す。詳しく →で他家健常ドナー由来の細胞から在庫型で製造するCAR-T。拒絶やGvHDを避ける改変を要する。詳しく →の細胞を作る話はゲノム編集の細胞治療と低免疫原性化の遺伝子編集で読めます。

参考文献

• Morgan RA, Yang JC, Kitano M, et al. Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2. Mol Ther. 2010;18(4):843-851.（HER2を標的にしたCAR-Tの死亡例）
• Roybal KT, Rupp LJ, Morsut L, et al. Precision tumor recognition by T cells with combinatorial antigen-sensing circuits. Cell. 2016;164(4):770-779.（synNotchによるANDゲート）
• Watanabe K, Terakura S, Martens AC, et al. Target antigen density governs the efficacy薬が本当に効くかを臨床の前に確かめる非臨床の有効性評価。細胞から動物まで段階的に行う。詳しく → of anti-CD20-CD28-CD3ζ chimeric antigen receptor-modified effector CD8+ T cells. J Immunol. 2015;194(3):911-920. PMID: 25520398. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25520398/
• Kloss CC, Condomines M, Cartellieri M, et al. Combinatorial antigen recognition with balanced signaling promotes selective tumor eradication by engineered T cells. Nat Biotechnol. 2013;31(1):71-75. PMID: 23242161. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23242161/
• Liu X, Jiang S, Fang C, et al. Affinity-tuned ErbB2 or EGFR chimeric antigen receptor T cells exhibit an increased therapeutic index against tumors in mice. Cancer Res. 2015;75(17):3596-3607.
• Fedorov VD, Themeli M, Sadelain M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Sci Transl Med. 2013;5(215):215ra172.（阻害性受容体によるNOTゲートの考え方）
• ClinicalTrials.gov, EVEREST-1: A2B530, a CEA Logic-gated Tmod CAR-T Cell Therapy（NCT05736731）。A2 Bio, EVEREST 1 trial safety and biomarker data, SITC 2024（2024年11月）
• FDA, Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)