CAR-Tのベクター選択：レンチウイルスとγレトロウイルス

けれども力価は、選定を左右する軸そのものではなく、そこだけを見ていると見落とします。核心は一点です。ベクターがゲノムのどこに、どんな設計で入り込むかが、標的細胞への入りやすさも挿入変異ベクターがゲノムに組み込まれる際、近くの遺伝子の働きを乱し発がんなどを招くリスク。詳しく →のリスクも、同時に決めています。製造の現場が抱える負担も、元をたどればここに行き着きます。

軸は2つあります。分裂依存性と、挿入変異のリスクです。この2つを起点に据えると、なぜレンチウイルス分裂していない細胞にも遺伝子を組み込めるレトロウイルスベクター。CAR-Tで広く使われる。詳しく →が主流になったのかが、単なる流行ではなく見えてきます。本稿では、実際の製造現場で使われているプラットフォームと試薬、品質管理遺伝子治療製品の品質・安全性・有効性を保証するために製造・出荷の各段階で実施する試験・管理の総体。詳しく →としてのRCR/RCLウイルスベクター製品に、増殖する能力を持つウイルスが生じていないか調べる安全性試験です。混入がないことを確認します。詳しく →試験、非ウイルス法との比較、そして選ぶ手順まで、順を追って整理します。

分裂依存性 ― 核へ入る経路の違い

γレトロウイルス分裂中の細胞にのみ遺伝子を組み込めるレトロウイルスベクター。安定産生株を作りやすい。詳しく →は分裂中の細胞にしか遺伝子を入れられません。レンチウイルスは静止期の細胞にも入ります。

差は核へ入る経路にあります。γレトロウイルスがゲノムに組み込むには、核膜がいったん壊れる細胞分裂の瞬間が要ります。活発に分裂している細胞でなければ遺伝子は届きませんが、一方でHIV-1由来のレンチウイルスは違います。核膜が保たれたままの核内へ、遺伝子複合体を運び込む仕組みを持ち、静止期でも導入できるということです。CAR-T製造では抗CD3/CD28ビーズT細胞の表面分子を刺激して増殖・活性化を促す試薬です。抗CD3と抗CD28を組み合わせたビーズなどが、細胞治療の培養で使われます。詳しく →で刺激してから導入するのが一般的です。だからγレトロウイルスでも実務上は成立します。実際、レンチウイルス系のKymriahとγレトロウイルス系のYescartaが、どちらも承認製品として使われています。ただし事情が変わる場面もあります。刺激条件を穏やかにして分化を抑えたい場合や、静止期に近いメモリーT細胞を保ちたい場合ほど、レンチウイルスの自由度が効いてきます。

標的細胞をどこまで増殖させる設計にするかという判断と、ベクター選択は切り離せません。

組み込み位置と挿入変異のリスク ― SIN構造がどう効くか

ゲノムのどこに入るかで、リスクの大きさが変わります。がん遺伝子本来は細胞増殖を促す正常遺伝子だが、活性化するとがん化のきっかけになりうる遺伝子。詳しく →を誤って活性化T細胞を抗原刺激や人工的な刺激試薬で活性化し、増殖・機能発揮できる状態に誘導する操作。詳しく →するかどうかです。

γレトロウイルスは、転写開始点やエンハンサーの近くに入りやすい傾向が知られています。過去に造血幹細胞遺伝子治療の初期試験で、この挿入がプロトオンコジーンを活性化し、白血病様の事象を引き起こした歴史があります。この教訓が、ベクター設計を大きく変えました。レンチウイルスは活発に転写されている遺伝子の本体内に入りやすいとされ、転写開始点への集中はγレトロウイルスほど強くありませんが、系統名だけで安全とは言い切れません。Oxford Biomedicaはレンチウイルスベクター宿主ゲノムに組み込まれる遺伝子導入ウイルス。長期発現できるが挿入変異のリスクが伴う。詳しく →専業として、第3世代と第4世代のプラットフォームを展開します。浮遊・灌流培養に対応し、内部プロモーターRNAポリメラーゼが結合して転写を開始するDNA上の特定の塩基配列領域。詳しく →を弱毒化する自己不活化ベクター内部のプロモーター/エンハンサーを弱め、周囲の遺伝子を活性化しにくくした設計。詳しく →(SIN)構造を標準にしています。Miltenyi Bioindustryも第3世代レンチウイルス産生の遺伝要素を4種のプラスミドに分割した設計世代。RCL発生のリスクを下げる安全設計。詳しく →のSINLTRから強いエンハンサーを除き、挿入変異のリスクを下げたウイルスベクターの設計。詳しく →構造を採用したGMPプラットフォームを持ちます。4Lのデモスケールから、50〜200Lの商用機へ直行できるとしています。

製造の現場 ― スケールとGMP到達期間という2つの軸

ウイルスベクター治療用の遺伝子を細胞へ運ぶために改変したウイルス。AAVやレンチウイルスが代表で、遺伝子・細胞治療に使う。詳しく →の製造は工程として重く、供給とコストのボトルネックになりやすい領域です。

専業CDMOごとに強みが分かれます。Lonzaは一過性トランスフェクションプラスミドを一時的に細胞へ導入してウイルスを産生させる方法。レンチ製造の主流。詳しく →と安定パッケージング細胞株ベクター粒子の骨格（Gag/Pol・Rev・外被タンパク質など）をゲノムに持つ細胞株。目的遺伝子は含まない。詳しく →の両方式に対応し、浮遊で50Lから2,000LまでcGMPで製造できます。Charles River Laboratoriesは数十年のGMP経験を持つLentivation™プラットフォームを展開しています。GMP到達までの期間を最大60%短縮し、7か月未満を目指すとしています。Minaris Advanced TherapiesのXLenti™は浮遊製造に特化しています。DNAからINDまで約1年という期間を掲げます。AGC BiologicsのProntoLVV™は付着750L、浮遊2,000Lまで対応します。GMP到達を約9か月で実現するとしています。国内ではTakara Bioが、浮遊培養細胞を容器壁に付着させず液中に浮遊させて増やす培養。バイオリアクターでの大容量化に向く。詳しく →3,000Lスケールに対応するGMP/GCTP再生医療等製品の製造管理及び品質管理の基準。日本で細胞培養加工施設での製造に適用される省令。詳しく →準拠のウイルスベクター製造を展開しています。

スケールとGMP到達期間のどちらを優先するかで、候補に挙がるCDMO医薬品の開発・製造を他社から受託する企業。設備投資を負わずに専門能力を使える。詳しく →はまったく違う顔ぶれです。

トランスフェクションと導入効率を上げる試薬

ベクターを作る側にも、細胞に運び入れる側にも、専用の試薬が使われています。

製造側で標準になっているのが直鎖ポリエチレンイミン正電荷を持つカチオン性試薬。負電荷のDNAと複合体を作り細胞へ導入するトランスフェクションに使う。詳しく →(PEI)です。Polyplus / Sartoriusの PEIpro / PEIpro-GMPは、HEK293細胞ヒト胎児腎臓由来の細胞。遺伝子導入効率が高く一過性発現に向くが、商業生産の実績はCHOより限定的。詳しく →でのマルチプラスミド・トリプルトランスフェクションに使われます。事実上の基準になっており、研究用・高品質用・GMP用の3グレードを揃えています。Thermo Fisher ScientificのLV-MAX Lentiviral Production Systemは、懸濁HEK293由来細胞での無血清製造に、専用のエンハンサーを組み合わせた系です。導入する側では、Takara Bioの組換えフィブロネクチン断片RetroNectin(rFN-CH-296)が使われてきました。造血幹細胞やリンパ球のex vivo患者やドナーから取り出した細胞を体外（生体外）で操作すること。編集や加工の後に体内へ戻す。詳しく →遺伝子治療で、長く標準法とされてきた試薬です。MerckのPolybrene(ヘキサジメトリンブロミド)は、ビリオンと細胞表面の電荷反発を中和低pH条件で溶出されたサンプルに緩衝液を加えてpHを中性付近に戻し、製品へのダメージを防ぐ操作。詳しく →します。導入効率を最大100倍から1000倍に高める、定番のカチオン性ポリマーです。QIAGENのSureENTRYは終濃度2〜8µg/mLで滴定して使う導入エンハンサーです。

試薬の選び方一つで、同じベクターでも到達できる導入効率が変わります。

増殖性ウイルスとコピー数という品質管理

複製能を持つウイルスが復活していないこと、ゲノムに入った回数が過剰でないこと。この2つは出荷前に必ず確認します。

RCR/RCL試験では、Bio-RadのVericheck ddPCR RCLキットが使われます。VSV-Gエンベロープ遺伝子を標的に、デジタルPCRで検出する方式です。QIAGENのQIAcuity RCL Quant Kitは検出限界0.35コピー/µLという感度を持ちます。SHENTEKの定量キットも、RCRを0.5コピー/µLまで検出できるとしています。ベクターコピー数遺伝子・細胞治療で、細胞1個あたりに組み込まれたベクターの平均コピー数です。導入効率や安全性を見る指標です。詳しく →(VCN)の側では、TATAA Biocenterの測定系が目安です。FDAとEMAが期待する水準として、CAR-T患者や健常ドナーのT細胞にCAR（キメラ抗原受容体）を導入し、がん細胞を攻撃させる細胞治療。詳しく →で1細胞あたり5コピー未満という基準に整合させています。GT MolecularのWPRE標的アッセイキットは、WHOの国際レンチウイルス標準で検証済みです。

力価が高いベクターほど、この2つの試験の検出感度が製造の合否を左右する場面が増えます。

項を一つ減らす ― トランスポゾンと非ウイルス法

ウイルス粒子を作る工程そのものを外せば、製造の負担は直接軽くなります。

Sleeping Beautyゲノムを動き回る転移因子を応用し、ウイルスを使わず遺伝子を組み込む非ウイルス法。詳しく →とpiggyBacは、ウイルスを使わずにCAR遺伝子をゲノムへ組み込むトランスポゾンです。ATUMのLeap-In Transposaseは、機械学習で設計した合成トランスポゾンを使います。活性クロマチンへ安定挿入する技術で、複数のORFを積んで抗体鎖の比率まで制御できます。ただし製造の負担が軽くなっても安全性が自動でついてくるわけではなく、Sleeping Beautyはゲノム上でほぼランダムに近い組み込みプロファイルを示します。一方でpiggyBacは、転写開始点やCpGアイランド近傍に入りやすい傾向が指摘されています。piggyBac由来のCAR-Tで、遺伝毒性化合物が遺伝子や染色体を傷つける性質。点突然変異や染色体損傷を含み、複数の試験で分担して調べる。詳しく →が疑われる重篤な有害事象の報告もありました。作りやすさと組み込みのクセは、別問題です。

非ウイルスだから安全という単純化はできません。

ベクターを選ぶ前に決めておく順番

最後に、確認の順番を整理します。

まず、標的細胞をどこまで分裂させる設計にするかを決めます。ビーズ刺激で強く増殖させてよいのか、静止期に近い細胞を残したいのかで、レンチウイルスの自由度が要るかどうかが決まります。次に、挿入変異のリスクをベクター構造で確認します。SIN化されているか、内部プロモーターの強さがどう設計されているかを、系統名だけでなく資料で読みます。そのうえで、候補CDMOのスケールとGMP到達までの期間を、自社のバッチサイズと開発スケジュールに照らします。数か月の差が、臨床試験の開始時期を動かします。最後に、RCR/RCLとベクターコピー数の試験系を、規制当局が求める検出感度に合わせて選びます。ここまで決めて初めて、力価という一つの数字に戻り、各社を比べる意味が出てきます。

参考文献

• Milone MC, O'Doherty U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 2018;32(7):1529-1541.（PMID: 29654266）
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• Hudecek M, Izsvák Z, et al. Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2017;52(4):355-380.
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• ICH. ICH Considerations: General Principles to Address the Risk of Inadvertent Germline Integration of Gene Therapy Vectors（CHMP/ICH/469991/2006）. 2006.