ファージディスプレイとパンニングの原理

この方法の核心は、「くっつくかどうか（表現型）」と「その抗体の設計図（遺伝子型その働きを生み出すもとになる遺伝子の配列情報。）」を、1つのウイルス粒子の中で一体にしてしまう発想にあります。表面に抗体を提示し、その抗体をコードする遺伝子を同じ粒子に内包する。こうしておけば、標的に結合した粒子を拾うだけで、その抗体の配列まで一緒に手元に残る。シンプルだが、これが決定的に強い仕掛けです。

その連結を土台に、結合・洗浄・回収・増幅を繰り返すパンニング結合・洗浄・回収・増幅を繰り返し、標的に結合するファージを段階的に濃縮する操作。で結合体を濃縮していきます。ライブラリの種類や選択圧洗浄の強さや抗原量で調整する選抜の厳しさで、残る抗体の質を方向づける。のかけ方が選抜の質を左右し、動物免疫に頼らない自由度と引き換えに、体内の親和性成熟を経ないという制約も背負う。結合という「働き」と、それを生む「情報」を離さずにつなぐ——ここがこの技術のすべての出発点です。ほかの取得法との位置づけは抗体の取得法もあわせてご覧ください。

表現型と遺伝子型を1つの粒子で連結する

ファージディスプレイの原理は、抗体の「働き」と「設計図」を同じ粒子に閉じ込めることにあります。

使うのはバクテリオファージ（細菌に感染するウイルス）です。よく用いられるのは糸状ファージ（filamentous phage大腸菌で増える細長いタイプのファージで、抗体提示によく用いられる。）と呼ばれる細長いタイプで、大腸菌の中で増えます。このファージ細菌に感染するウイルス。表面に抗体断片を提示させ、その設計図の遺伝子と一体で選抜に使う。の表面には外殻を構成するいくつかのタンパク質があり、その一つに抗体断片をつなげて表面に出す（提示する）ように遺伝子を組み替える。それだけの操作で、粒子はすでに「抗体を身にまとった状態」になります。

提示させる抗体断片の遺伝子は、ファージ自身のゲノム（あるいは付随するファージミド提示する抗体断片の遺伝子を組み込んだ、ファージに付随する小さなDNA。と呼ばれる小さなDNA）に組み込まれています。つまり表面に出ている抗体は、その粒子の中にある設計図から作られたもの。粒子を1個手に取れば、「表面の抗体が何に結合するか」と「その抗体の配列」が必ず対応しています。ここが決定的に便利な点です。標的に結合した粒子だけを選べば、あとはその粒子が持つ遺伝子を読むだけで配列がわかります。

提示される抗体断片には、軽鎖と重鎖の可変領域抗体の抗原を認識する先端部分。CDRとフレームワーク領域からなり、標的にフィットするかで結合が決まる。をひとつながりにした scFv重鎖と軽鎖の可変ドメインを短いペプチドリンカーでつないだ1本鎖の抗体フラグメント。多価化しやすい。（single-chain variable fragment、一本鎖可変領域断片）や、可変領域と定常領域抗体の可変領域以外の、配列がほぼ一定な領域。抗原認識には関わらずクラスや機能・血中半減期を担い、ヒト化では早期にヒト配列へ置き換える。の一部を含む Fab重鎖の一部と軽鎖がジスルフィドで連結した約50kDaの抗体フラグメント。2本鎖で折りたたみがやや複雑。（fragment antigen-binding、抗原結合断片）がよく使われます。いずれも完全な抗体（IgG）そのものではなく、標的への結合を担う部分を取り出した小さめの断片。全長より扱いやすく、ファージ表面に提示させやすいためです。

パンニング ― 結合・洗浄・回収・増幅を繰り返す

パンニングは、結合するものだけを選んで濃縮するサイクルを、繰り返して純度製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →を上げていく操作です。

パンニング（panning結合・洗浄・回収・増幅を繰り返し、標的に結合するファージを段階的に濃縮する操作。）という名前は、砂金採りのように、目的のものだけを何度もふるい分けて残していくイメージから来ています。1回の操作は、大きく4つのステップで進みます。

1つ目は、結合させる工程です。多様な抗体を提示したファージの大集団（ライブラリ）を、標的抗原を固定した容器やビーズに触れさせます。標的に合う抗体を提示した粒子は、抗原にくっついて留まる。

2つ目は、洗浄です。容器を洗い、結合していない（あるいは結合の弱い）粒子を流し去ります。ここでどれだけ厳しく洗うかが、残る粒子の性質を左右する。実務上、最も判断を要するステップの一つです。

3つ目は、回収です。抗原に留まった粒子を、条件を変えて（pHを下げるなど）はがし取り、集めます。

4つ目は、増幅です。回収した少数の粒子を大腸菌に感染させて増やし、次の選抜に回せるだけの量を確保します。ファージが自分で増えてくれるこの性質こそ、ディスプレイ技術の強みでもあります。

この4ステップを1ラウンドとして、通常は数ラウンド繰り返します。ラウンドを重ねるたびに、標的によく結合する粒子の割合が高まっていく（濃縮）。最初は目的の抗体を出す粒子がごくわずかでも、結合するものだけを残して増やす操作を反復すれば、その割合を段階的に押し上げられます。最終的に残った粒子の遺伝子を読めば、標的に結合する抗体の配列が得られます。

ライブラリの種類 ― ナイーブ・免疫・合成

どんな配列の集団から選ぶかで、ライブラリは大きく3種類に分けられます。

パンニングの出発点になるのが、多様な抗体を並べたライブラリです。何をもとに多様性を作るかで、性格が変わります。

ナイーブライブラリ免疫していない多数のヒト提供者のB細胞から集めた、標的に偏らない抗体集団。は、免疫を受けていない多くの人のB細胞から抗体遺伝子を集めたもので、特定の標的に偏っていません。一つ用意しておけば、さまざまな標的に対して使い回せるのが利点です。免疫ライブラリ特定の抗原で免疫した個体から作る、その抗原に反応する配列に富む抗体集団。は、目的の抗原で免疫した個体から作るため、その抗原に合う配列がもともと多く含まれます。狙いが定まっている場合に結合体を得やすい反面、標的ごとに作り直す手間があります。

合成ライブラリ天然の配列に頼らず、可変部を人工的に多様化して設計した抗体集団。は、天然の配列に頼らず、抗体の骨格を決めたうえで結合に関わる部分（可変部）の配列を人工的に多様化して作ります。天然にない組み合わせも含められ、多様性の設計に自由度がある点が持ち味です。とくにヒト由来の骨格だけで組めば、はじめから完全ヒト抗体配列がほぼ全てヒト由来の抗体。ファージディスプレイやトランスジェニックマウスで取得する。（配列がヒト由来の抗体）を狙う土台になります。どのライブラリを使うかは、標的が決まっているか、汎用性を優先するか、といった目的に応じて選ばれます。

選択圧と濃縮 ― どう「厳しく」選ぶか

選択圧を調整することで、単にくっつく抗体ではなく、より強く結合する抗体へ絞り込めます。

パンニングは、ただ結合するものを残すだけの操作ではありません。「どのくらい厳しい条件で選ぶか」を調整して、残る抗体の質を方向づけられる。この「厳しさ」を選択圧と呼びます。

代表的なつまみは、洗浄の強さです。洗いを厳しくすれば、弱くしか結合しない粒子ははがれて落ち、強く結合する粒子が残りやすくなります。抗原の量を減らすのも一つの手で、抗原が少ないほど限られた結合の場を強い抗体が奪い合うかたちになり、親和性抗体が抗原に結合する強さ。解離定数などで表し、値が小さいほど強く結合することを示す。の高いものが選ばれやすくなります。ラウンドを進めるにつれて洗浄を厳しくしたり抗原量を減らしたりして、少しずつ選択圧を上げていく組み立てがよく取られます。

一方で、選択圧を上げれば多様性は失われていきます。厳しくしすぎると、たまたま条件に合った少数だけが残り、有望だった候補まで落としてしまうことがある。逆にゆるすぎると、目的でない結合（容器や固定材料へのくっつき）まで残って濃縮が進みません。強く絞りたい要求と多様性を確保したい要求のあいだで、ラウンド数や条件を釣り合わせる——これが現場の判断どころです。濃縮が進んでいるかは、ラウンドごとに回収される粒子の数や結合の強さの変化を見ながら確かめていきます。

動物免疫に依存しない利点

動物を介さないことが、免疫困難な標的や毒性標的、完全ヒト抗体づくりで効いてきます。

ファージディスプレイのいちばんの持ち味は、生き物の免疫応答を必要としない点です。動物に抗原を打って抗体ができるのを待つ工程がない。ここから、いくつかの実務的な利点が生まれます。

まず、免疫が起きにくい標的に使えます。自分の体の成分に近い抗原（自己抗原）は、動物の体が「異物ではない」と見なして反応しにくいこと（免疫寛容免疫系が特定の抗原に反応しない状態。自己抗原に近い標的では動物から抗体が取りにくくなる。）があり、免疫を利用する方法では抗体が取りにくくなります。試験管内の選抜なら、この免疫寛容の影響を受けずに探せます。

次に、毒性の強い抗原にも対応できます。動物に打てば害になるような物質でも、試験管の中で標的として使うぶんには問題になりにくく、選抜の対象にできます。

そして、はじめから完全ヒト抗体を狙えます。ヒトの抗体遺伝子だけでライブラリを組んでおけば、選び出される抗体の配列はヒト由来です。動物で作った抗体をヒトに合わせて作り替える（ヒト化マウス抗体の抗原認識部だけを残し、それ以外をヒト配列に置き換えて免疫原性を下げる工程。する）工程を経ずに、ヒト配列の抗体へ直接たどり着けます。ヒトに近づけるための手法の位置づけは抗体の取得法で他法と並べて整理しています。

こうした特徴は、この技術の広がりにもつながりました。ファージディスプレイによる抗体・ペプチドの選抜は、2018年のノーベル化学賞の対象となっています（半分をジョージ・スミス氏とグレゴリー・ウィンター氏が受賞。スミス氏がファージディスプレイの手法を、ウィンター氏がそれを用いた抗体の選抜を確立したことが評価されました）。

in vitro選抜ゆえの限界 ― 人工的な親和性成熟

試験管内で選ぶぶん、体内の親和性成熟変異を入れてより強く結合する抗体変異体を選び、落ちた結合を回復・向上させる工程。を経ないので、結合を後から人工的に磨く工程が要ります。

利点の裏返しになる限界もあります。動物の体内で抗体ができるとき、免疫応答の中で抗体は繰り返し変異と選択を受け、標的への結合が少しずつ強まっていきます。これを親和性成熟と呼びます。ファージディスプレイは体内のこの過程を経ないため、最初のラウンドで得られる抗体は、そのままでは結合が弱いことがあります。

この場合、親和性成熟を人工的に再現します。得られた抗体の配列に狙って変異を入れ、少しずつ違う配列の小さなライブラリを新たに作り、より強く結合するものをまたパンニングで選び出す。この操作を繰り返すことで、結合を後から高めていきます。体内で自然に起きることを、試験管の中で意図的にやり直す——そういうかたちです。

もう一つ、in vitro生きた動物の体外で、試験管やシャーレなどを用いて細胞・組織・分子レベルで行う実験を指す用語。で選ぶがゆえの注意点があります。選抜は「標的に結合するか」を主に見ているため、抗体としての作りやすさ（発現しやすさ）や安定性、体内での挙動といった性質までは、選抜の中で保証されません。選抜後に、これらの性質を別途評価し、必要なら配列を調整する工程が続きます。得られた抗体の結合の強さや特異性分析法において、共存する不純物・分解物・添加剤などが存在しても目的成分だけを正確に測定できる能力。は、SPR／BLIによる結合速度論のような手法で定量的に確かめられます。

まとめ

ファージディスプレイは、抗体断片をファージ表面に提示し、その遺伝子を同じ粒子に内包することで、「くっつくか（表現型分子が標的に結合するかなど、実際に現れる働き・性質のこと。）」と「配列（遺伝子型）」を1粒子で連結する技術です。この連結があるから、標的に結合した粒子を拾うだけで配列まで手に入る。選抜はパンニングと呼ばれ、結合・洗浄・回収・増幅を1ラウンドとして繰り返し、結合するものを段階的に濃縮していきます。

出発点となるライブラリには、汎用のナイーブ、標的に富む免疫、設計自由度の高い合成があり、目的に応じて選ばれます。洗浄の厳しさや抗原量で選択圧を調整すれば、単にくっつくだけでなくより強く結合する抗体へ絞り込めますが、絞りすぎは多様性の喪失と背中合わせです。

動物免疫に依存しないことが、免疫困難な標的・毒性標的・完全ヒト抗体づくりでの強みになります。一方で、体内の親和性成熟を経ないため、得られた抗体は人工的な親和性成熟で結合を磨き直すことが多く、発現目的タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で転写・翻訳させ、機能的なタンパク質として産生させる工程。性や安定性は選抜後に別途詰める必要があります。利点と限界の両方を踏まえて、ほかの取得法と使い分けたり組み合わせたりする——それが実情に近いところです。

参考文献

• Smith GP. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 1985;228(4705):1315-1317.
• McCafferty J, Griffiths AD, Winter G, Chiswell DJ. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 1990;348(6301):552-554.
• The Nobel Foundation, The Nobel Prize in Chemistry 2018（ファージディスプレイの受賞）
• ICH S6(R1)バイオ医薬品の非臨床安全性評価の考え方を示すICHガイドライン。種選択などの枠組みを定める。, Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals