解説記事NEW06/24
低分子原薬（API）の製造工程とは？ 化学合成から晶析・乾燥まで、収率・不純物・結晶多形の管理
低分子原薬（API）の製造工程を、出発物質の準備、多段の化学反応、後処理（抽出・洗浄）、晶析、ろ過・乾燥、粉砕まで順に整理します。
分析 ・ 低分子・製剤
類縁物質・不純物分析（HPLC）とは？
類縁物質は、原薬の合成・分解で生じる構造の近い不純物です。
- 代表的な方法
- 勾配RP-HPLC（UV/PDA検出）によるstability-indicating法
類縁物質を管理する理由
- 類縁物質は安全性・品質に影響しうる
- 合成・分解・保存で生成する
- ICH Q3A/Q3Bで報告・同定・限度が定められる
関わる規制ガイドライン
この試験を受ける会社・キット
低分子医薬ではICH Q3A/Q3Bに基づき、主にHPLCで分離・定量し、個々および総量を規格内に管理します。核酸医薬のn-1など合成由来不純物にも同じ考え方が適用されます。
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手法の比較 ― どの方法で測るか
| 手法 | 原理 | 何が分かる | 使い分け |
|---|---|---|---|
| RP-HPLC | 逆相で類縁物質を分離・定量 | 個々/総類縁物質（%） | 類縁物質試験の主力 |
| LC-MS | 質量で不純物構造を同定 | 不純物の同定・帰属 | 未知不純物の同定 |
| IP-RP-HPLC（イオン対逆相） | アルキルアミン等のイオン対試薬を用い逆相で核酸鎖長別に分離 | n-1/shortmer・longmer等の合成由来不純物（%） | オリゴ核酸医薬（ASO/siRNA）の類縁物質の主力法 |
| キャピラリー電気泳動（CE） | 電荷/サイズ差で電気泳動分離 | 核酸の鎖長別純度・関連不純物 | HPLCと別の原理の分離選択性、オリゴ純度確認 |
| CAD/ELSD検出HPLC | UV吸収の弱い不純物を質量応答的に検出 | 非発色団不純物・カウンターイオン等 | UV検出で見落とす分解物の補完検出 |
現場の基準 ― 装置・パラメータ
★ 代表的な基準法勾配RP-HPLC（UV/PDA検出）によるstability-indicating法
代表的な装置・ベンダー
- UHPLC/HPLC本体（QC標準機。UV/PDA検出、CDS連携でデータインテグリティ確保）Waters Alliance iS / Alliance iS（バイオ用Bio構成）、Agilent 1290 Infinity II/III LC、Thermo Scientific Vanquish Core、Shimadzu Nexera／i-Series（LC-2050/2060）Waters、Agilent、Thermo Fisher Scientific、Shimadzu
- 未知不純物の構造同定・帰属（LC-UV/PDAでの定量を補完するMS別の原理）Waters Xevo／SYNAPT、Thermo Orbitrap（Exploris/Q Exactive）、Agilent 6500 Q-TOFWaters、Thermo Fisher Scientific、Agilent
主な管理パラメータ
カラム：C18等逆相（粒子径・内径・長さ。例 2.1–4.6mm×50–250mm、1.7–5µm）と固定相選択性移動相組成・pH・緩衝液（リン酸/ギ酸/酢酸アンモニウム等）と勾配プログラム（%B経時）流速・カラム温度・注入量（過負荷とピーク変形の管理）検出波長（UV/PDA、主波長＋スペクトル取得）と検出感度（S/N）希釈液（diluent）組成と試料安定性・オンカラム分解の回避システム適合性：分離度Rs、テーリング係数、理論段数、繰返し精度（RSD）、検出感度（S/N）定量法：面積百分率法／相対応答係数（RRF）補正、報告閾値以上の不純物のみ計上ランタイム・カラム再平衡化、ブランク・プラセボ干渉の確認
出典ICH Q3A(R2)ICH Q3B(R2)ICH M7(R2)ICH Q2(R2)ICH Q1A(R2)USP <621>Ph.Eur. 2.2.46
許容基準・別の方法での確認・落とし穴を見る
なぜこれが基準法か
類縁物質試験の代表的基準法。逆相C18系カラムでの勾配溶離により、構造の近い類縁物質・分解物を高分離能で分離し、UV/PDA検出で個々および総量を面積百分率法で定量する。各極で調和されたUSP<621>／Ph.Eur. 2.2.46／JPの一般試験法に準拠し、ICH Q3A(R2)／Q3B(R2)の報告・同定・規格閾値に対して個々/総類縁物質を管理する。強制分解で主成分から全分解物を分離できることを示し、stability-indicating性を担保する。
典型的な許容基準・規格
個々/総類縁物質の規格はICH Q3A(R2)（原薬）・Q3B(R2)（製剤）の閾値に基づく。最大1日投与量(MDD)≤2g/日では報告閾値0.05%・同定閾値0.10%（または摂取量1.0mg/日のいずれか低い方）・規格化(qualification)閾値0.15%（または1.0mg/日）、MDD>2g/日では各0.03%/0.05%/0.05%。未知不純物・特定不純物・総量を規格に設定する。変異原性不純物はICH M7に従い別途管理。システム適合性はUSP<621>／Ph.Eur. 2.2.46／JP（2022年12月調和）に準拠（分離度・繰返しRSD・検出感度等）。方法バリデーションはICH Q2(R2)（特異性・直線性・範囲・精度・正確性・LOD/LOQ・頑健性）、強制分解はICH Q1A(R2)に基づき実施し、ピーク純度（PDA/MS）とマスバランス（一般に95%以上）でstability-indicating性を確認。核酸医薬のn-1等合成由来不純物も同様の考え方で管理。
別の方法での確認
RP-HPLC（UV/PDA）で得た不純物プロファイルは、(1) LC-MS/HRMSによる質量・構造同定で各ピークを帰属し、(2) 別の原理の選択性を持つ別モード（HILIC、イオン対RP、または異なる固定相・pH条件）で共溶出不純物の有無を検証する。ピーク純度はPDAスペクトル比較に加えMSで確認。核酸医薬ではIP-RP-HPLC（n-1/shortmer等）と陰イオン交換（AEX）・キャピラリー電気泳動を相補的に用いる。強制分解（酸/塩基/酸化/光/熱）で生成した分解物を網羅し、マスバランスで未検出経路の有無を確認する。
よくある落とし穴と対処
- 分解物と主成分・他不純物が共溶出し、過小評価される（特異性不足）PDAピーク純度評価とLC-MSによる別の方法での確認を方法開発段階から実施。勾配・固定相選択性を見直し、強制分解試料で全分解物の分離を確認する
- 応答係数の差により面積百分率法で含量を誤評価（UV吸光が主成分と大きく異なる不純物）主要・特定不純物について相対応答係数(RRF)を求めて補正。RRFが0.8–1.2の範囲外なら個別に補正係数を適用する
- 希釈液中・オートサンプラ放置中の試料分解でアーティファクト不純物が増加希釈液組成（pH・有機溶媒比）と試料安定性を検証し、オートサンプラ温度管理と分析までの保持時間を規定する
- マスバランスが取れず（主成分減少に不純物増加が見合わない）、検出されない分解経路を見落とす検出波長の最適化（UV吸収の弱い分解物の見落とし回避）、揮発性/非UV分解物はCAD/MS等の補完検出を併用し、マスバランス95%以上を確認する
- 報告閾値未満のピークやブランク/プラセボ由来ピークを誤って計上ICH Q3A/Bの報告閾値で計上下限を設定し、ブランク・プラセボ・既知不純物標準で帰属を確定してから計上する
こんな場面で使う
- 原薬・製剤の類縁物質確認
- 安定性試験での分解物モニタリング
- ICH Q3A/Q3Bに基づく規格適合
主な測定項目
- 個々の類縁物質（%）
- 総類縁物質（%）
- 未知不純物の同定
類縁物質を評価するときのポイント
報告・同定・規格の閾値（ICH Q3A/B）を設定する
分解物は強制分解試験で帰属する
RP-HPLCの分離条件・検出を最適化する
未知不純物はLC-MSで構造を推定する
安定性での経時変化を追跡する
規格としての個々/総量を管理する