mRNAのキャップ率はなぜ88〜98%と幅が出るのか：LC-MS論文を読む

Proglenth 編集部公開 2026-07-22更新 2026-10-09約6分で読めます

同じキャッピング酵素で処理したmRNAなのに、キャップが付いた割合が88%から98%まで、10ポイントも違った。LC-MSでmRNAのキャップ率を測る方法を2016年に報告したBeverlyらの論文には、そんな結果が載っています。

原因は酵素ではなく、mRNAの側にありました。取り込んだ修飾塩基の種類と、鎖の長さで、同じ方法でも値が変わったのです。キャップ率は、キャップの付け方が決める設計値ではありません。その品目を測って、初めて分かる数字です。

規格を決める人にも、受託分析の報告書を読む人にも、メーカーの「効率95%」の資料を見る購買や営業の人にも、数字の背景を読み取る手がかりになる内容です。測定法の全体はキャッピング効率の測定に譲り、ここでは論文の中身に絞ります。

論文の方法 ― 末端だけを切り出して質量を読む

Beverlyらの方法は、標識を使わずに、mRNAの先頭だけを取り出して質量を量ります。

手順は4段です。まず、mRNAの5'末端に結合するビオチン付きのDNAプローブ（目印になる短い鎖）を加えます。次に、RNase H（DNAと対になったRNA側だけを切る酵素）が、プローブの位置でRNAを切ります。切り出された断片は、ストレプトアビジンを付けた磁気ビーズでプローブごと拾い、最後にLC-MSで質量を量ります。質量から、キャップのない末端（5'三リン酸のまま）か、Cap 0か、Cap 1かが分かり、それぞれの量が出ます。蛍光や抗体で標識する方法と違い、標識反応そのもののばらつきが入りません。

先頭を切り出す理由は、キャップの質量が小さいからです。2,000塩基ほどのmRNAでは、キャップの有無は全体の質量の0.1%に届かない違いで、丸ごと測っても見えません。断片が20塩基ほどなら質量は7,000 Da前後で、Cap 0とCap 1の差であるメチル基1個（14 Da）が、約0.2%の違いとして読めます。

この方法の強みは、キャップの種類を質量で読み分けられることと、標識のばらつきが入らないことです。

88〜98% ― 同じ酵素で、10ポイントの幅

論文の結果でいちばん目を引くのは、キャップ率の幅です。

ワクシニアウイルス由来のキャッピング酵素で処理した複数のmRNAのキャップ率は、88%から98%でした。幅を生んだのは、取り込んだ修飾塩基の種類と、mRNAの鎖長です。シュードウリジンと5-メチルシチジンを含む、約2,200塩基と約9,000塩基のmRNAも、問題なく測れています。

ここから読み取れることは二つあります。一つは、同じ酵素で付けても、mRNAが違えば同じ値が出るとは限らないことです。もう一つは、10ポイントの幅が、規格を「95%以上」に置いたときに、合否を分けるほど大きいことです。ロットごと、品目ごとに測らなければ、出荷の判定にはなりません。キャップを共転写で一度に付ける方式（CleanCap共転写キャッピング）を選んでも、最終の裏取りはこの種の測定です。

キャップ率は、付け方が決める設計値ではなく、その品目で測って初めて分かる値です。

0.5〜25% ― どこまで薄い量を拾えるか

測定法の信頼性は、薄い量をどこまで正しく拾えるかで決まります。

論文では、キャップのあるmRNA 100 pmolに、キャップのない（5'三リン酸のままの）mRNAを混ぜ、混ぜた割合どおりに読めるかを調べました。0.5%から25%の範囲で、直線的に検出できています。たとえば規格が「キャップありが95%以上」なら、残りの5%以下を判定する範囲は、この確認の中に入っています。逆に、0.5%を下回る少なさは、この確認の外です。

受託先の報告書や、メーカーの資料にある「検出限界」も、こうした混ぜ込み試験で確かめた範囲かどうかを聞く価値があります。

測れる範囲を混ぜ込みで確かめていない測定は、規格の下限に近い値を判断できません。

この測定だけでは見えないもの ― 向き、全長、ポリA

先頭だけを切り出す方法は、先頭以外を捨てています。

まず、キャップの向きです。共転写で従来のキャップ類似体m7GpppGを使うと、キャップが付いた転写物の3分の1から2分の1で、キャップが逆向きに入ると報告されています（Pasquinelliらの1995年の報告を、Stepinskiらの2001年の論文が引いています）。逆向きと正しい向きは、原子の組成が同じで質量が変わりません。Beverlyらの論文は向きの判定にも触れていますが、質量の読み取りだけでは分けられないので、保持時間のような質量以外の手がかりが要ります。逆向きの取り込みを起こさないように設計されたキャップ類似体（ARCA）を選んで、発生源を断つ手もあります（mRNAのキャッピング）。

次に、残りの部分です。先頭を切り出したあとの本体は捨てるので、全長の分布も、ポリA尾部の長さも、二本鎖RNAの混入も、この測定の外にあります。全長を見るイオンペア逆相HPLCによるmRNA分析と、尾部を見るポリAテールの長さ分析に役割を分けます。

切り出しの精度も、結果に響きます。RNase Hは、狙いの位置のまわりで余計に切ることがあります。Agilentは2021年のASMSで、耐熱性のRNase Hを50℃で使うと、37℃で見られた余計な産物が消えたと報告しました。切断の精度を詰めた2026年の論文はmRNAキャップ効率、前処理1.5時間にで解説しています。

明日から確かめられること

論文の88〜98%は、そのまま自社の数字にはなりません。自社の品目で測定を組むとき、受託分析の報告書を読むときの確認点です。

品目ごとに、プローブと切断の条件を決め直したか。温度、塩濃度、酵素量、反応時間を手順として固定したか
修飾塩基を使う品目で、切り出した断片の理論質量を計算し直したか。N1-メチルシュードウリジンなら、ウリジン1個につき14 Da増える（N1-メチルシュードウリジン）
合格の定義は、Cap 1だけか、Cap 0を含む「キャップあり」か。内訳をロットごとに残しているか
測れる範囲を、キャップのない試料を混ぜる試験で確かめたか
逆向きキャップは、保持時間などで分けるのか、キャップ類似体の選択で断つのか
方式や試薬を変える前後を、同じ測定法で比べる計画があるか

測定に使う装置と試薬は、製品データベースのLC-MS、mRNAのキャップ/ポリA・完全性評価、逆相HPLCカラムで比べられます。核酸原薬の品質管理の全体像は核酸医薬の品質管理にあります。

参考文献

Beverly M, Dell A, Parmar P, Houghton L. Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem. 2016;408(18):5021-5030.（ビオチン付きプローブとRNase Hによる切り出し、88〜98%の幅、0.5〜25%の混ぜ込み試験）
Stepinski J, Waddell C, Stolarski R, Darzynkiewicz E, Rhoads RE. Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'-deoxy)GpppG. RNA. 2001;7(10):1486-1495.（ARCAの設計。逆向きが3分の1から2分の1という数字は、同論文が引くPasquinelliらの1995年の報告による）
Agilent Technologies, ASMS 2021 ポスター FP568（耐熱性RNase Hを用いたmRNA 5'キャップ解析）