レンチウイルスの力価測定：物理力価と機能力価をどう読むか

この取り違えが起きるのは、レンチウイルス分裂していない細胞にも遺伝子を組み込めるレトロウイルスベクター。CAR-Tで広く使われる。の「力価」という数字に、性質の異なる二つの物差しが同居しているからです。粒子が物理的にいくつあるかを数える物理力価粒子が物理的にいくつあるかを測った力価。感染性の有無は問わず、p24やベクターRNAの量から求める。と、そのうち実際に細胞へ遺伝子を届けられるものがいくつあるかを数える機能力価実際に細胞へ遺伝子を届けられた粒子を数える力価。効き目に最も近く、TUやVCN、陽性率から求める。。レンチウイルスでは両者が2〜3桁ずれるのがふつうです。どちらで測った値かを取り違えると、投与設計も品質比較も桁単位で狂います。

レンチウイルスベクター宿主ゲノムに組み込まれる遺伝子導入ウイルス。長期発現できるが挿入変異のリスクが伴う。は、CAR-T細胞をはじめとする体外遺伝子改変（ex vivo患者やドナーから取り出した細胞を体外（生体外）で操作すること。編集や加工の後に体内へ戻す。）で中心的に使われる運び屋です。患者や提供者の細胞へ目的の遺伝子を組み込むこの工程では、ベクターをどれだけ加えるかが、細胞の改変効率にも組み込まれる遺伝子のコピー数にも直結します。だからこそ、その入り口にある力価を正しく読むことが最初の関門になります。物理力価（p24 ELISA・逆転写酵素活性レンチウイルスが持つ、RNAをDNAに写す酵素の活性。粒子量を間接的に見積もる物理力価の指標。）と機能力価（形質導入単位形質導入を起こせる粒子の数を表す機能力価の単位。TU/mLで表し、MOI計算の分母に使う。TU・qPCR核酸を増幅しながら蛍光の増え方を追い、標的DNA・RNAの量を測る装置です。増幅の立ち上がりの早さから濃度を求めます。詳しく →によるインテグレーション定量・フローサイトメトリー）はそれぞれ何を測っているのか。MOIや両者の比はどう読めばよいのか。力価がぶれる要因や標準化がなぜ難しいのかも含め、AAV遺伝子治療で遺伝子を運ぶウイルスベクター。血清型によって集まりやすい組織が異なる。など他のベクターとの違いも見比べながら順にほどいていきます。

大きく出る数字と、効く数字

冒頭のMOI細胞1個あたりに接触させるウイルスやベクターの量の比。形質導入の効率やベクターコピー数を左右する条件。 5の例で「大きく出た数字」の側にいるのが、物理力価です。物理力価は粒子がいくつ存在するかを測るもので、感染性の有無は問いません。測り方として代表的なものが二つあります。

• p24 ELISA抗原と抗体の結合を酵素反応による発色などで検出し、目的の物質の有無や量を測る手法です。不純物や力価の測定に広く使われます。詳しく →⁠：ウイルスの内部（コア）を構成するGagタンパク質レンチウイルスの構造を作るタンパク質群。その一部であるp24が物理力価の測定に使われる。の一部であるp24レンチウイルスのコアを作るGagタンパク質の一部。抗体で捕まえて定量し、粒子の総量（物理力価）を推定する。を、抗体で捕まえて定量します。1本の粒子あたりのp24量から粒子数を推定でき、換算の目安としてp24 1 pgあたり物理粒子およそ1×10⁴個というオーダーがよく使われます。ただしp24は、遊離した可溶性タンパク質としても、感染性を持たない不完全粒子の中にも存在します。そのためp24 ELISAが拾う量は「粒子の総量」寄りで、実際に効く量よりかなり大きく出ます。
• 逆転写酵素RNAを鋳型にして相補的なDNA(cDNA)を作る酵素です。RNAの検出や定量、cDNA作製の最初の工程で使います。詳しく →（RT）活性⁠：レンチウイルスはRNAウイルスで、標的細胞に入ると逆転写酵素で自らのRNAをDNAに写します。この酵素の活性を測ることで、粒子量を間接的に見積もれます。近年はPCRと組み合わせて感度を高めた製品逆転写酵素（PERT逆転写酵素の活性をPCRと組み合わせて高感度に測る方法。粒子量の指標として使う。）法などが使われます。これも酵素量、すなわち粒子量の指標であって、感染性そのものではありません。

物理力価の利点は、生きた細胞を使わないため速く、変動が比較的小さい点にあります。ロット内の一貫性を見るモニタリング指標としては扱いやすい。一方で、「患者で効く量」からは離れています。冒頭の失敗は、この「離れている」ことを飛ばして投与設計に使ったために起きました。

一方、効く数字の側にいるのが機能力価です。実際に細胞へ遺伝子を届けられた粒子を数える指標で、効き目に最も近い物差しといえます。標的細胞にベクターを加え、その結果を読み取って求めます。代表的なアプローチは次のとおりです。

• 形質導入ウイルスベクターを介して細胞に外来遺伝子を導入すること。導入細胞の割合が形質導入効率として評価される。単位（TU）：ベクターを段階希釈して細胞に加え、遺伝子が組み込まれた（形質導入された）細胞の割合から、単位体積あたり何個の粒子が形質導入を起こせるかを算出します。単位はTU/mLベクターが実際に細胞へ入り遺伝子を発現させられる、機能を持つ粒子の数を測る指標。ゲノム力価との比が質の目安になる。。機能力価の基本単位です。
• qPCRによるインテグレーション定量⁠：形質導入した細胞集団のゲノムDNAを回収し、組み込まれたベクター配列のコピー数を定量PCR（またはデジタルPCR）で測ります。細胞1個あたり平均何コピー組み込まれたか、すなわちベクターコピー数遺伝子・細胞治療で、細胞1個あたりに組み込まれたベクターの平均コピー数です。導入効率や安全性を見る指標です。詳しく →（VCN）を出せます。
• フローサイトメトリー細胞を一つずつ測定し、表面マーカーや性質を調べる手法です。細胞の種類・純度・活性の確認に使います。詳しく →⁠：ベクターが蛍光レポーターや細胞表面マーカー細胞表面に出るタンパク質などの目印。MSCではCD73・CD90・CD105の発現などで細胞を見分けます。（CAR特定の抗原を認識するよう設計し、細胞に導入して指向性を与える人工の受容体。分子など）を運ぶ場合、それを発現目的タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で転写・翻訳させ、機能的なタンパク質として産生させる工程。した細胞の割合を1細胞ずつ数えます。低MOIで測れば1細胞に1コピー組み込まれた前提が成り立ちやすく、陽性率から力価を逆算できます。

いずれも生きた細胞を使うため、細胞の種類・状態、形質導入から測定までの時間、培養条件でぶれやすく、物理力価より変動が大きくなりがちです。それでも「効く量」に最も近い。だから力価管理の要になります。

MOIの計算は、どちらの数字を分母にするか

冒頭の食い違いに戻ります。感染多重度細胞1個あたりに接触させるウイルスやベクターの量の比。形質導入の効率やベクターコピー数を左右する条件。（MOI: Multiplicity Of Infection）は、加えたベクター量を細胞数で割った値です。MOI 5なら、細胞1個あたり形質導入単位5個ぶんのベクターを加えたことになります。分母に何を置くかが分かれ道で、MOIは必ず機能力価（TU/mL）で計算します。

物理力価（p24換算の総粒子数）をそのままTUとして扱ってMOIを計算すると、有効な量を100〜1,000倍も水増しした設計になりかねません。実際にはごく一部しか形質導入しないため、「MOIを高くしたつもりが細胞がほとんど改変されない」という、まさに冒頭のずれが起きます。

MOIは細胞改変の帰結にも直結します。MOIを上げれば形質導入率とベクターコピー数（VCN）は上がりますが、コピー数が高すぎると挿入変異による腫瘍化リスクが増すため、実務ではVCNを一定以下に抑える運用が一般的です。CAR-T患者や健常ドナーのT細胞にCAR（キメラ抗原受容体）を導入し、がん細胞を攻撃させる細胞治療。細胞などのex vivo製品では、規制当局への申請でVCNの管理が求められ、細胞あたり平均コピー数を低め（目安として1桁前半以下）に設定する例が知られています。効かなさすぎても効きすぎても困る。MOIはそれだけ慎重に据えるべき数字です。

粒子100個あたり1個、という歩留まり

なぜ物理力価と機能力価がこれほどずれるのか。その答えは、両者の比を取るとはっきりします。物理力価を機能力価で割ると、粒子いくつあたり1個が形質導入を起こせるかという粒子/感染性比物理粒子数を感染力価で割った比。大半の粒子が感染に寄与しないレンチウイルスでは100〜1,000程度になる。が得られます。レンチウイルスではこの比が100:1から1,000:1程度になることが多く、大半の粒子が形質導入に寄与しない不完全粒子であることを示します。冒頭で数字が桁でずれたのは、この歩留まり製造工程で投入した原料や中間体に対し、最終的に規格に合った製品として回収できた割合を指し、低いほどコスト増につながる。の悪さが背景にあります。

この比は、単なる説明にとどまらず工程の状態を映す鏡にもなります。比が悪化した（感染性の割合が下がった）ときは、精製での粒子損傷、凍結融解によるダメージ、製剤の劣化などが疑われます。レンチウイルスはエンベロープ一部のウイルスが持つ脂質の外膜。レンチウイルスではVSV-Gなどをまとうが、温度・剪断・凍結融解に弱い。を持つ壊れやすい粒子で、こうした要因の影響を受けやすいベクターです。工程開発では、濃縮や精製で総量を増やしながらこの比を保てるか、すなわち壊さずに増やせるかが評価軸になります。

AAVでは、この文脈で語られるのは主に「空／実比」（中身が空のカプシドの割合）で、粒子の物理的な内訳を見る指標です。レンチウイルスでは空カプシドゲノムを内包しないAAVの殻。治療効果に寄与せず、必要な量を届けるための総投与カプシド量を押し上げる不純物として扱われる。という概念のかわりに、粒子/感染性比が実質的な「どれだけ効くか」の物差しになります。物理力価と機能力価を分けて測る一般論は、ウイルスベクターの力価測定でも扱っています。

同じ「TU/mL」でも中身が違う

ここまでで、力価は測り方で対象が変わることが見えてきました。もう一つ注意したいのは、同じ機能力価の中でも条件が違えば値が動くことです。同じベクターでも、標的細胞・測定条件・標準品力価の基準に定めた品。検体と同じアッセイで並べて測り、相対力価の基準にする。が違えば力価は変わります。とくに機能力価は次の要因で動きます。

• 標的細胞⁠：形質導入のしやすさは細胞株ごとに違います。同じベクターでも、使う細胞が変われば得られるTUが変わるため、施設間で細胞をそろえないと値は比較できません。
• エンベロープ（シュードタイプ）：レンチウイルスは表面タンパク質を差し替えて指向性を変えられます。よく使われるVSV-G型は多くの細胞に入りますが、シュードタイプが違えば感染性も変わります。
• 形質導入補助⁠：ポリブレンなどの試薬やスピノキュレーション（遠心による接触促進）は形質導入率を押し上げ、見かけの力価を変えます。
• 物理力価側の要因⁠：p24 ELISAは標準品・キットで絶対値が動き、遊離p24を拾うため過大評価に傾きます。

こうした感度の高さのため、ベンダーやキットが示す性能は各社の公表値（自己申告）にすぎません。自施設の試料・細胞・条件での確認が欠かせない。「同じTU/mL」という表記だけを見て別々のロットや製品を並べても、中身が同じとは限らないということです。

数字を並べる前に確かめること

以上を踏まえると、レンチウイルスの力価は測定法ごとに測る対象が違い、機能力価は細胞や条件でぶれるため、施設や製品をまたいで数字を比べること自体が難しい領域だとわかります。ロット間・施設間・製品間の比較が本質的に難しくなるのは、この構造的な理由からです。

この課題に対して、共通の物差しをつくる国際的な取り組みが進んできました。WHO（世界保健機関）は、レンチウイルスベクターの初のInternational Standard（国際標準品）の開発を報告しています。共通の標準品を介して各施設の値を相対化できれば、絶対値のずれを抑えて比較しやすくなります。

とはいえ標準品が普及するまでの間も、数字は並べざるをえません。比較する前に、次の点を確かめておくと安全です。

• 物理力価か機能力価か。土台が違えば桁が違います。
• 機能力価なら、どの標的細胞・どの条件で測ったか。
• 物理力価なら、どの標準品・単位系か。

冒頭のMOIの取り違えも、この最初のチェック――そもそも物理力価か機能力価か――を通していれば防げたものでした。レンチウイルスを含む遺伝子治療製品の品質管理全体の枠組みは、遺伝子治療の品質管理で整理しています。力価はその中で、上流から製剤まで繰り返し測る通しの指標です。

参考文献

• FDA, Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications
• FDA, Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products
• ICH Q5A(R2), Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin
• Zhao Y, Stepto H, Schneider CK. Development of the First World Health Organization Lentiviral Vector Standard: Toward the Production Control and Standardization of Lentivirus-Based Gene Therapy Products. Hum Gene Ther Methods. 2017;28(4):205–214. PMID: 28747142
• Geraerts M, et al. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 2006;6:34. PMID: 16836756