アデノウイルスベクターの製造工程とは？ワクチン・がん治療での使いどころ

一方で、アデノウイルスに対する免疫はヒト集団に広く存在し、投与により強い自然免疫・獲得免疫応答を誘導しうる点が最大の論点です。この強い免疫原性は、体内で長く発現を続けたい治療用ベクターとしては制約になります。ところが「免疫を起こすこと」そのものが目的の遺伝子ワクチンや、がん細胞を壊す腫瘍溶解性ウイルスがん細胞で選択的に増殖して細胞を破壊するよう設計されたウイルス。強い免疫応答を治療に利用する。では、同じ性質がむしろ利点として働きます。アデノウイルスベクター治療用の遺伝子を細胞へ運ぶために改変したウイルス。AAVやレンチウイルスが代表で、遺伝子・細胞治療に使う。の使いどころは、この免疫原性薬そのものが患者の免疫応答を誘発しやすい性質。凝集体や不純物、投与経路、患者背景などが要因になる。の裏表をどう活かすかで決まります。

本稿では、アデノウイルスベクターの特徴と、複製欠損型・E1相補細胞という設計の基本、ワクチンや腫瘍溶解性ウイルスでの用途、培養から精製までの製造工程、そして品質を語るうえで欠かせない感染力価ウイルスベクターが実際に細胞へ感染する能力を表す力価。TCID50などのアッセイで測る。と物理力価粒子が物理的にいくつあるかを測った力価。感染性の有無は問わず、p24やベクターRNAの量から求める。の考え方を順に整理します。ベクター全体の選び方は 遺伝子治療ベクターの選び方 にゆずり、ここではアデノウイルスに絞って見ていきます。

アデノウイルスベクターの4つの特徴

アデノウイルスベクターの性格は、大きく4つの特徴で整理できます。

第一に高い力価です。適切な産生細胞を使えば培養容量あたり多数の感染性粒子が得られ、大量投与が前提のワクチンや、腫瘍に直接届ける用途に向きます。第二に大きな搭載量です。第1世代ベクターでも約8kb、ウイルス遺伝子をほぼ削ったヘルパー依存型（gutless／高容量型）では最大およそ36kbまで積めるとされ、大型の発現カセット導入する遺伝子とその発現を制御する配列をひとまとめにした構成単位。搭載容量の制約に関わる。や複数遺伝子に対応できます。

第三に非組込み・一過性発現遺伝子をゲノムに組み込まず一時的に発現させる方式。短期間で少量の抗体を得るのに向く。です。ゲノムに組込まれずエピソーム染色体に組み込まれず核内に環状で残るDNA。AAVの導入遺伝子はこの形で発現する。として働くため、挿入変異ベクターがゲノムに組み込まれる際、近くの遺伝子の働きを乱し発がんなどを招くリスク。のリスクは相対的に低い一方、分裂細胞では希釈により発現が減衰しやすくなります。第四に強い免疫原性です。既存免疫と強い応答誘導は、反復投与や全身高用量では炎症反応の管理を難しくしますが、免疫を誘導したい用途では武器になります。

複製欠損型とE1相補細胞

治療やワクチンに使うアデノウイルスベクターの多くは、体内で勝手に増えないように設計された複製欠損型（複製不能型）です。ウイルスの増殖に必須なE1領域アデノウイルスゲノムの初期転写領域の一つで、ウイルス複製開始に必要なタンパク質をコードする領域。を欠失させることで、投与した細胞の中で新たなウイルス粒子をつくれないようにします。多くの設計ではE3領域アデノウイルスゲノムの初期転写領域の一つで、宿主免疫応答の回避に関わる遺伝子を含む領域。も併せて削り、その分を目的遺伝子の搭載スペースに充てます。

問題は、E1を欠いたウイルスは自分では増やせないため、製造時にE1の働きを外から補う必要があることです。そこで用いられるのが、アデノウイルスのE1領域をあらかじめ染色体に組込んだE1相補細胞株アデノウイルスのE1遺伝子を染色体に組み込んだ細胞株で、E1欠失ベクターの製造時にE1機能を補完する。です。代表がHEK293ヒト胎児腎由来の細胞株。アデノウイルスのE1機能を持ち、AAV産生の三重トランスフェクションで広く使われる。（ヒト胎児腎由来）で、細胞側がE1タンパク質を供給することで、E1欠失ベクターでも培養系の中でだけ増殖・産生できます。

このとき注意すべきが、複製能力をもつアデノウイルス（RCAウイルスベクター製品に、増殖する能力を持つウイルスが生じていないか調べる安全性試験です。混入がないことを確認します。詳しく →）の混入です。ベクターと細胞ゲノム上のE1配列との組換えによって、E1を取り戻した増殖性ウイルスが生じうるためです。RCAの否定は品質管理の重要項目で、相同配列の重なりを減らした細胞株・ベクター設計や、工程での試験が組み合わされます。品質試験の全体像は 遺伝子治療の品質管理 を参照してください。

用途：ワクチンと腫瘍溶解性ウイルス

アデノウイルスベクターがもっとも力を発揮するのが、強い免疫原性を「利用する」用途です。

遺伝子ワクチンでは、抗原タンパク質の遺伝子を複製欠損型アデノウイルスに載せて投与し、体内で抗原を発現させて免疫応答を誘導します。高力価で大量製造しやすく、強い細胞性・液性免疫を引き出せることが利点です。課題は既存の抗アデノウイルス免疫で、これを避けるために、ヒトでの保有率が低い血清型AAVのカプシドの種類による分類。組織指向性が異なり、狙う臓器や細胞に応じて選び分けられる。（Ad26やAd35など）やサル（チンパンジー）由来アデノウイルスを基盤に用いる設計が採られてきました。

腫瘍溶解性ウイルスでは、逆にウイルスの複製能を活かします。がん細胞で選択的に増えて細胞を破壊するよう設計された条件付き複製型アデノウイルス特定の細胞環境（主にがん細胞）でのみ選択的に増殖できるよう遺伝子改変されたアデノウイルス。を腫瘍に投与し、直接的な細胞溶解界面活性剤や物理的破砕で細胞膜を壊し、細胞内に蓄積したカプシドを液中へ放出させる工程。に加え、放出された腫瘍抗原とウイルス由来の炎症シグナルによって抗腫瘍免疫を引き出すことを狙います。この場合は「増える」ことが治療の一部なので、複製欠損型とは製造・安全性設計の考え方が変わります。

製造工程：培養から精製まで

アデノウイルスベクターの製造は、E1相補細胞でウイルスを増やす培養（アップストリーム抗体製造のうち、細胞を増やして抗体を作らせる培養までの上流工程。ハーベスト以降の下流と区別する。）と、そこから取り出して仕上げる精製（ダウンストリーム培養液から抗体を分離・精製する下流工程。清澄化からProtein A、ポリッシュ、UF/DFまでを指す。）に分かれます。骨格は他のウイルスベクターと似ていますが、多くのアデノウイルスは産生後も細胞内にとどまる性質があるため、細胞を壊してウイルスを回収する工程が要になります。

培養・感染

HEK293などのE1相補細胞を増やし、シードとなるベクターを感染させて増幅します。懸濁培養のバイオリアクター細胞やウイルスの培養を制御された環境下で大規模に行うための培養槽で、商業規模の製造に用いられる。へ移行することで容量を確保しやすくなります。感染から回収までのタイミング（感染多重度細胞1個あたりに接触させるウイルスやベクターの量の比。形質導入の効率やベクターコピー数を左右する条件。や培養時間）が、収量と粒子の品質を左右します。

溶解・清澄化

産生されたウイルス粒子の多くは細胞内に蓄積するため、界面活性剤や凍結融解などで細胞膜を壊し、粒子を液中へ放出させる細胞溶解（ライシス）界面活性剤や凍結融解などの処理で細胞膜を破壊し、細胞内に蓄積したウイルス粒子を液中へ放出させる工程。を行います。溶解液には大量の宿主DNAが含まれるので、ベンゾナーゼなどのエンドヌクレアーゼ核酸を分解する酵素です。製造では培養由来の残存DNA/RNAを分解・除去して製品の純度を高める目的で使い、ベンゾナーゼが代表例です。詳しく →で遊離核酸を断片化します。続く清澄化では、デプスフィルターろ材の厚み全体で不純物を捕らえる深層ろ過フィルターで、細胞培養液の清澄化など、細胞残渣や粒子を多く含む液の一次ろ過に使います。詳しく →などで細胞片や凝集物を除き、後段のクロマトに送れる澄んだ液に整えます。

クロマトグラフィー精製

古典的には塩化セシウム密度勾配超遠心が使われてきましたが、スケールアップ性の観点からクロマトグラフィーへの置き換えが進んでいます。アデノウイルス粒子は表面電荷が強い負に帯電しているため、陰イオン交換クロマトグラフィー（AEX）正電荷のリガンドで負電荷を帯びた不純物を吸着除去する方式。DNAやエンドトキシンの低減に使う。が捕捉・精製の主力になります。仕上げにサイズ排除クロマトグラフィー多孔質の担体を通る時間差で分子をサイズ順に分離し、抗体の凝集体や断片がどれくらい含まれるかを測る手法です。詳しく →やTFF（限外ろ過・透析ろ過）で不純物除去とバッファ交換・濃縮を行い、最後に無菌ろ過微細な孔のフィルターに液を通し、菌などの微生物を取り除く工程です。加熱できない製品を無菌にする手段で、0.22µm前後の膜が広く使われます。詳しく →して製剤化します。AAV遺伝子治療で遺伝子を運ぶウイルスベクター。血清型によって集まりやすい組織が異なる。の精製との対比は AAVベクターの製造工程 もあわせて参照してください。

感染力価と物理力価

アデノウイルスベクターの品質を語るとき、力価には性格の異なる二つがあります。

一つが物理力価（物理的粒子数）です。溶解した粒子の260nm吸光度から総粒子数を求める方法や、AEX-HPLC、ウイルスゲノムを標的にしたqPCRなどで、液中にウイルス粒子が何個あるかを測ります。もう一つが感染力価で、実際に細胞へ感染して機能する粒子がどれだけあるかを、TCID50やプラークアッセイ、あるいはヘキソン発現などを指標にした感染価アッセイで測ります。

重要なのは、粒子の多くが必ずしも感染性ではない点です。総粒子数に対する感染単位の比（粒子/感染単位比、P/I比）は、製品ロットの一貫性や充填設計にかかわる重要品質特性として管理されます。物理力価だけが高くても感染力価が伴わなければ、期待する効果は得られません。二種類の力価をどう測り分け、どう解釈するかは ウイルスベクターの力価測定 で詳しく整理しています。

AAV・レンチウイルスとの違い

同じ遺伝子治療ベクターでも、アデノウイルスはAAVやレンチウイルスと性格が大きく異なります。

AAVは直径20〜26nmと小さく搭載量が約4.7kbと限られる一方、免疫原性が比較的おだやかで、分裂の少ない組織での長期発現に向くin vivoの主力です。アデノウイルスは搭載量が大きく高力価ですが、強い免疫原性と一過性発現ゆえに、持続発現よりワクチン・腫瘍溶解性用途に向きます。レンチウイルスはエンベロープを持つ組込み型で、体外で細胞を安定改変するex vivo細胞治療の標準ツールという、また別の立ち位置です。レンチウイルスの製造は レンチウイルスの製造工程 にまとめています。

このように、どのベクターを選ぶかで産生方式も精製戦略も品質項目も変わります。用途からの逆算という全体像は 遺伝子治療ベクターの選び方 にまとめているので、比較の出発点として活用してください。

まとめ

アデノウイルスベクターは、高力価・大きな搭載量・非組込み・強い免疫原性という4つの特徴を持つ運び屋です。治療で長く発現させたい用途にはAAVやレンチウイルスにゆずる場面が多い一方、強い免疫応答を活かす遺伝子ワクチンや、複製能でがん細胞を壊す腫瘍溶解性ウイルスでは、その特徴がそのまま強みになります。

製造は、E1相補細胞（HEK293など）でウイルスを増やし、細胞溶解でウイルスを回収し、清澄化を経て陰イオン交換を軸に精製する流れが基本です。複製欠損型ではRCAの否定が、品質評価では物理力価と感染力価の測り分けが要点になります。用途・設計・製造・品質は一続きでつながっているため、使いどころを見極めるほど、工程設計と規格の意味が立体的に見えてきます。

参考文献

• ICH Q5A(R2), Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin.
• FDA, Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)（Guidance for Industry, 2020）.
• FDA, Guidance for Industry: Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products など遺伝子治療関連ガイダンス（CBER）.
• EMA, Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products (EMA/CAT/80183/2014).
• 日本薬局方 参考情報「遺伝子治療用製品の製造及び品質管理に関する基本的考え方」.
• PMDA／厚生労働省「遺伝子治療用製品等の品質及び安全性の確保に関する指針」.