リガンド結合法(LBA)のバリデーション：ICH M10の確認項目と落とし穴

リガンド結合法（LBA）は、抗体が相手の分子にくっつく反応を使って、血液などの生体試料に含まれる薬の濃度を測る方法で、ELISA抗原と抗体の結合を酵素反応による発色などで検出し、目的の物質の有無や量を測る手法です。不純物や力価の測定に広く使われます。詳しく → が代表例です。抗体医薬の血中濃度は、多くの場合この方法で測ります。

ただし、くっつく反応を数える測り方なので、反応を邪魔するものに弱く、薬が濃すぎるとかえって低い値が出ることもあります。こうした測り損ねを本番の前に洗い出す作業が、バイオアナリシスのバリデーション試験法が目的に合う性能を持つことを立証する妥当性確認。正確さ・精度などを評価する。詳しく →です。

この記事では、LBAの仕組み、現場でよく起きる四つの測り損ね、本番の検体で測り直すISR、ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。詳しく → M10 の適用時期と対象外、受託先と確かめる点を順に説明します。

1. LBAの仕組み ― 結合した分子の数を信号で読む測り方

LBA は、薬の重さではなく、くっつく反応を数える測り方です。そのため、くっつきを邪魔するものに弱くなります。

臨床試験で薬が体の中にどれだけ残るかを語るとき、根拠は血液検体を測った数字です。半減期薬の血中濃度が半分に下がるまでの時間。抗体フラグメントでは短く、延長の工夫が要る。詳しく →も、用量を上げてよいかどうかも、そこから導きます（動態の読み方は半減期とクリアランスで解説しています）。

測定がずれていれば、その上に積んだ判断も同じ向きにずれます。しかも、ずれた数字も見た目は普通の数字です。

低分子の薬は、液体クロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。詳しく →と質量分析を組み合わせた LC-MS/MS液体クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせ、断片を一つずつ読んで配列や修飾部位を特定する手法。詳しく → で、分子を分けて重さで見分けながら測れます。抗体医薬は分子量が数百倍あって扱いにくいため、LBA が主役です（酵素でペプチドに切ってから LC-MS液体クロマトグラフで成分を分離したうえで質量分析計にかけ、分子量を測って物質の同定や定量を行う手法です。詳しく →/MS で測る方法もあります）。

LBAでは、プレートに固定した捕捉抗体で薬をつかまえ、そこへ標識した検出抗体をかぶせて、色や光の強さで量を読み取ります。捕捉抗体と検出抗体が薬を挟み込んだ形になるため、サンドイッチ法捕捉抗体と検出抗体で目的物を挟んで検出するELISAの方式。HCPの総量測定で標準的に使われる。詳しく →と呼びます。

結合した分子の数を信号として読む測り方なので、捕捉抗体に結合するほかの成分や、薬と形の似た分子が血液の中にあると、値が狂います。

使う試薬が生き物由来という弱みもあります。捕捉抗体や検出抗体はロットごとに性質が少しずつ違い、作り直すと同じ検体でも値が動くことがあります。

装置は ELISA のほか、電気化学発光を使う Meso Scale Discovery（MSD）の系や、微小な流路で反応させる Gyros Protein Technologies の Gyrolab がよく使われますが、原理が免疫反応である点はどれも同じです。

M10 が求める精度と正確さの許容幅は、LBA のほうがひと回り広く、おおむね±20%です（クロマトグラフ法は±15%）。

基準が緩いのではなく、もともとぶれやすい測り方なので、そのぶん確かめる項目が増えます。

2. 現場でよく起きる四つの測り損ね

LBA の測り損ねは、反応がうまく組み上がらない場面で起きます。代表は四つです。

一つ目が、薬が濃すぎると低く出るフック効果です。薬が多すぎると、捕捉抗体と検出抗体がそれぞれ別々の薬分子とくっついてしまい、サンドイッチが閉じません。

投与直後の高い濃度の検体ほど、本当は高いのに低い値として報告される危険があります。M10 は、検量線の上限を超える検体を薄めて測るときのために、上限を超える濃度でフック効果が出ないことと、薄めても比例した値が出ること（希釈直線性）をあわせて確かめるよう求めています。

図をダウンロード（会員・無料）

二つ目は、人による血液の違いです。関節リウマチの患者が持つリウマチ因子や、動物の抗体に反応してしまうヒトの抗体（異好性抗体）は、捕捉抗体と検出抗体を橋渡しして、薬がないのに信号を出すことがあります。

M10 は LBA の選択性目的物と不純物を、溶出位置をどれだけ離して分けられるかの度合い。分離の分解能を左右する。詳しく →（ほかの成分に惑わされないこと）を、少なくとも10人分の血液で確かめるよう求めています。クロマトグラフ法の6人より多く、患者で使う分析法なら患者の検体でも確かめます。

三つ目は、薬の標的や抗薬物抗体投与した抗体医薬を異物とみなして患者の免疫系が作る抗体。薬の効果低下や安全性の問題を招く。詳しく →（ADA：薬に対して体が作る抗体）による邪魔です。抗体医薬が血中で標的とくっついていると、捕捉抗体が薬をつかめないことがあります。

このとき測っているのは標的から離れている「遊離型」で、「総量」ではありません。どちらを測ったかで動態の読み方が変わる点は、抗体のPK/PDと抗薬物抗体の記事でも触れています。

四つ目は、重要試薬（critical reagent）のロット切り替えです。数年続く臨床開発の途中で捕捉抗体を作り直すと、同じ分析法のはずなのに前の試験と値が揃わないことがあります。M10 は、変更の大きさに応じて、新旧を比べて性能を確かめることを求めています。

3. 本番の検体で測り直すISR

バリデーションでは、薬を含まない血液に標準品力価の基準に定めた品。検体と同じアッセイで並べて測り、相対力価の基準にする。詳しく →を加えた検体を使います。本番の患者検体には、代謝物、抗薬物抗体、併用薬、病気に伴う血液成分の変化など、標準品を加えた検体にはないものが混ざっています。

そこで、実際に測った検体の一部を別の日に測り直し、最初の値と一致するかを確かめます。これが ISR（Incurred Sample Reanalysis：実試料の再分析）です。

きっかけは、2006年に米国で開かれた AAPS と FDA（米国食品医薬品局）の合同ワークショップで、標準品を加えた検体と投与を受けた人の検体では挙動が違いうる、という問題意識から提案されました。

M10 では、ヒトで最初の臨床試験、主要な生物学的同等性二つの製剤が同程度に全身へ届くことを示すこと。後発品の評価などで用いる。詳しく →試験（後発品が先発品と同じように体に吸収されるかを比べる試験）、患者での主要な初期試験、肝臓や腎臓の機能が低下した人での試験などで求められます。動物の試験でも、原則として動物種ごとに少なくとも1回は行います。

合格ラインは、LBA の場合、測り直した検体の3分の2以上で、1回目と2回目の差が両者の平均の3割以内に収まることです。測り直す数は、最初の1,000検体まではその1割、超えた分は5%が目安です。

ISR で外れたとき、原因は標準品や検量線ではなく、検体の側に潜んでいることがよくあります。抗薬物抗体が邪魔をしている、検体が保存中に分解している、検体を取り違えている、といった原因です。

合格率だけで安心せず、外れた検体に共通点がないかを見ます。

4. 適用時期・対象外・受託先のデータ管理

確かめる項目は国際ガイドラインの ICH M10 で揃えられ、日本では2024年12月4日の厚生労働省の通知で取り入れられました。化学分析法と LBA に分かれていた旧ガイドラインは廃止されています。

2025年9月30日までに始まった分析は旧通知に沿ったデータでも申請に使えますが、10月1日以降に始まる分析は M10 の項目を満たす必要があります。米国は2022年11月、欧州は2023年1月に M10 を適用しており、日本は2025年10月からです。

海外の受託先に日本向けの試験を頼むときも、同じ M10 を物差しにして確かめられます。

もうひとつ、M10 の対象に入らない測定があります。ADA の測定と、バイオマーカーの測定です。同じ ELISA でも求められる考え方が違うため、「M10 に沿って検証済み」という言葉が、どの測定についてなのかを確かめます。

測定データの信頼は、分析法の出来だけでは決まりません。インドのプネーにある受託試験機関（CRO）の Synapse Labs では、査察で試験データの不整合や記録の不備、データを管理する仕組みの欠陥が見つかりました。

EMA は、この機関が試験を担当した400品目以上の後発医薬品を見直し、2023年12月、生物学的同等性変更前後が完全に同一でなくても、品質・安全性・有効性で高い類似性を保ち差異が悪影響しないと言える状態。詳しく →を別のデータで示せなかった品目の販売承認について一時停止を勧告しました。2024年3月の再審査でも、勧告は基本的に維持されています。

問題になったのは生物学的同等性試験二つのものの差があらかじめ定めた許容範囲に収まることを示す統計手法。「差がない」ではなく「同等である」ことを積極的に示すために使います。詳しく →のデータ管理で、LBA の性能ではありません。受託先を選ぶときは、分析法の中身に加えて、データを記録し管理する仕組みまで確かめます。

5. 明日から確かめられること

分析を委託するときや、届いた報告書を読むときは、次の順に確かめます。

1. 分析の開始時期⁠：分析がいつ始まったかを確かめます。2025年10月以降の開始なら、M10 の項目を満たしているかを見ます。
2. 遊離型か総量か⁠：測っているのが遊離型か総量かと、捕捉に何を使っているかを確かめます。
3. 選択性の確認人数⁠：選択性を何人分の血液で確かめたかを聞きます。LBA は少なくとも10人分で、患者で使う分析法なら患者の検体でも確かめます。
4. 希釈とフック効果⁠：濃い検体を薄めて測るなら、希釈直線性とフック効果をあわせて確かめたかを見ます。
5. 重要試薬の在庫⁠：捕捉抗体や検出抗体があと何年分あるかと、ロットを切り替えるときに新旧で何を比べるかを聞きます。
6. ISRの中身⁠：ISR を合格率だけでなく、外れた検体に共通点がないかまで見ているかを確かめます。
7. 検証済みの範囲⁠：「M10 に沿って検証済み」とあるのが、どの測定のことかを確かめます（ADA とバイオマーカーは対象外です）。
8. データの管理⁠：データの記録と管理の仕組みを、受託先に説明してもらえるかを確かめます。

重要試薬の在庫とロット切り替えの手順は、開発の後半で慌てないために、早い段階で聞いておく項目です。

受託先と測定装置の候補は、PK/免疫原性バイオアナリシス（受託）でまとめて比べられます。報告書の数字の読み方は、AUC・Cmax・Tmaxとは？に続きます。

参考文献

• ICH M10: Bioanalytical Method Validation and Study Sample Analysis（Step 4、2022年5月24日）
• 厚生労働省 医薬薬審発1204第1号「生体試料中薬物濃度分析法バリデーション及び実試料分析に関するガイドライン」について（2024年12月4日）
• EMA: ICH guideline M10 on bioanalytical method validation and study sample analysis（Step 5、EU発効2023年1月21日）
• EMA: Synapse Labs Pvt. Ltd: EMA recommends suspension of medicines over flawed studies（2023年12月、2024年1月更新）
• EMA: Synapse referral（2024年3月21日 再審査の結論）
• Viswanathan CT, et al. Quantitative bioanalytical methods validation and implementation: best practices for chromatographic and ligand binding assays. AAPS J. 2007;9(1):E30–E42.