オーバーフロー代謝と酢酸生成とは？酸素があっても糖を捨てる理由

培養や発酵を担当する人だけでなく、培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。詳しく →や株を提案する営業、スケールアップ先の槽を選ぶ購買や品質保証の人にも、どんなときに酢酸が出て、何を記録しておけば見つかるのかを押さえられる内容です。

オーバーフロー代謝の仕組み ― Pta-AckA経路

排水口より蛇口が大きければ、水はあふれます。オーバーフロー代謝は、これと同じ構図です。

大腸菌に糖（グルコース微生物発酵でエネルギー源となる糖類などの炭素源と、目的遺伝子の発現を促す誘導物質のことです。詳しく →）を与えると、糖は解糖系でピルビン酸解糖系で生じる代謝中間体。ミトコンドリアで処理しきれない分が乳酸へ変換される。、アセチルCoAへと分解され、呼吸の回路（TCA回路）で酸素を使って完全に酸化され、エネルギーと二酸化炭素に変わります。ところが糖の取り込みが速すぎると、回路でさばききれないアセチルCoAが、Pta-AckA経路を通って酢酸になり、菌体の外へ出ていきます。酸素が足りないから起きるのではなく、酸素があっても起きるので、好気的酢酸生成とも呼ばれます。

なぜ、さばききれる以上に取り込むのでしょうか。2015年のBasanらの研究は、細胞の中のタンパク質の資源には限りがあり、速く増えているときは、呼吸の設備を増やすより、酢酸に流すほうが少ない資源で済む、という説明を示しました。捨てているように見えても、菌にとっては合理的な選択ということです。ただ、実務で押さえる点は変わりません。速く増やそうとするほど、炭素は副産物へ漏れやすくなります。

酢酸による3つの問題

一つ目は、炭素の浪費です。与えた糖の一部が、菌体にも目的タンパク質にもならずに出ていくので、糖あたりの収率が下がります。

二つ目は、増殖と発現の阻害です。酢酸は弱い酸で、細胞の中に入り込んで内部のpHと膜のエネルギーの差を乱すと考えられています。一定以上たまると、増殖が遅くなり、組換えタンパク質遺伝子組換えで微生物や細胞に作らせた目的タンパク質。宿主により折りたたみやコスト、糖鎖が異なる。詳しく →の発現目的タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で転写・翻訳させ、機能的なタンパク質として産生させる工程。詳しく →も下がることが、繰り返し報告されています（Eitemanらの2006年の総説）。

三つ目は、運転と下流への負荷です。酢酸でpHが下がるので、中和低pH条件で溶出されたサンプルに緩衝液を加えてpHを中性付近に戻し、製品へのダメージを防ぐ操作。詳しく →のアルカリの添加が増えます。培養液の組成も変わり、あとの精製で除くべき成分が増えます。高密度発酵で菌体の密度が伸び悩むとき、背景に酢酸の蓄積があることがよくあります（高密度発酵と酸素供給）。

酢酸が出やすい場面 ― 流加・DO・スケールアップ・宿主株

大スケールの例は、論文に残っています。Enforsらは2001年に、22立方メートルの槽で大腸菌の流加培養培養の途中で栄養（フィード）を追加しながら細胞を高密度まで育てる培養方式。詳しく →を行い、小さな槽と比べました。大きな槽では、酸素が足りない領域が槽の中を動き回り、酢酸が作られては再び使われることが繰り返され、菌体の収率が下がる一因になっていると考察しています。糖を入れる位置のまわりだけ濃くなる現象も、小さな槽では混ざりが速いために見えません（微生物発酵のスケールアップ）。

株の違いも大きく、発現によく使われるBL21系統と、クローニングに使われるK-12系統のJM109を、高グルコースのバッチ培養で比べた報告があります。BL21は酢酸が2 g/L以下にとどまったのに対して、JM109は最大14 g/Lまで出ました（Shiloachらの研究）。発現用の株を選ぶ段階で、副産物のリスクをある程度、下げられるということです。

酵母でも事情は似ています。パン酵母（Saccharomyces cerevisiaeパン・ビール酵母として食経験が長い酵母。遺伝子操作ツールが豊富で、経口・食品関連の用途と親和する。詳しく →）は、クラブトリー効果が強く、糖が多いとエタノールに流れます。組換えタンパク質の生産でPichia pastoris（Komagataella phaffiiメタノールを炭素源にできる酵母。強力なAOX1誘導と分泌生産に向き、高密度培養で組換えタンパク質を作る。詳しく →）がよく使われる理由の一つは、この傾向が弱いことです（酵母での組換えタンパク質生産）。

酢酸の記録と対策の順番

酢酸は、測らなければ見つかりません。直近の発酵の記録で、糖の添加量、DO、pH（またはアルカリの添加量）、酢酸の濃度を、1枚のグラフに重ねてみてください。糖を足した直後に酢酸が立ち上がっていれば、与える速さが処理能力を超えています。酢酸は、培養液を抜き取り、HPLCイオン対試薬を使い疎水性の差で分ける液体クロマト。一本鎖と二本鎖RNAの分離やdsRNA除去に使われます。詳しく →や酵素法転写後に酵素でキャップを付ける方式。高いキャッピング率を得やすい。詳しく →のキットで測るのが一般的です。糖や乳酸を測る分析装置を使っているなら、測定項目に酢酸が入っているかが、選ぶときの確認点です（代謝・培地成分確認、バイオプロセス分析計）。

対策は、効きやすい順に三つです。一つ目は、糖を与える速さの設計で、フィードフェドバッチで追い足す濃縮した栄養液。いつ・どれだけ・どう入れるかが生産性と品質を左右する。詳しく →の出し方の違いは発酵培地とフィード設計にまとめています。二つ目は、DOを切らさない酸素の供給です。三つ目は、副産物を出しにくい宿主の選択です。

宿主の改良では、酢酸を作る経路の遺伝子（ptaやackA）を止める試みが古くからあります。ただ、単純に止めると、行き場を失った炭素がピルビン酸のような別の副産物になることがあり、代謝全体のバランスを見た設計が要ります。運転の工夫と株の選択は、どちらか一方ではなく、組み合わせて使うのが現実的です。

発酵記録と提案の確認項目

発酵の記録や、培地・株・槽の提案を前にしたら、次の点を見てみてください。

• 酢酸（酵母ならエタノール）の濃度を、糖の添加量とDOと同じ時間軸で記録しているか
• 糖を足した直後にpHが下がったり、アルカリの添加が増えたりしていないか
• 流加の速さは、菌体量の見積もりに合わせて決めているか。見積もりが外れたとき、どう気づくか
• DOが下限に張りつく時間帯はないか。高密度になったときの酸素の余力は十分か
• 宿主の株は、酢酸の出やすさを踏まえて選んだか
• 小スケールで酢酸が出ていなくても、大スケールの糖を入れる位置と混合を検討したか

培地の候補は大腸菌 高密度発酵用培地・フィードで、検討用の槽は卓上型バイオリアクターで比べられます。運転方式の違いは微生物発酵の運転方式に、工程全体は微生物発酵（大腸菌）の製造工程にあります。

参考文献

• Eiteman MA, Altman E. Overcoming acetate in Escherichia coli recombinant protein fermentations. Trends Biotechnol. 2006;24(11):530-536.（酢酸と増殖、発現の関係）
• Basan M, et al. Overflow metabolism in Escherichia coli results from efficient proteome allocation. Nature. 2015;528(7580):99-104.
• Enfors SO, et al. Physiological responses to mixing in large scale bioreactors. J Biotechnol. 2001;85(2):175-185.（22 m3の槽での大腸菌の流加培養、酸素制限域と酢酸）
• van de Walle M, Shiloach J. Proposed mechanism of acetate accumulation in two recombinant遺伝子組換え技術を用いて微生物や細胞に目的タンパク質を産生させることで製造された成分を指し、動物由来成分を含まない点が特徴。詳しく → Escherichia coli strains during high density fermentation. Biotechnol Bioeng. 1998;57(1):71-78.（BL21とJM109の酢酸の蓄積）
• Lee SY. High cell-density culture of Escherichia coli. Trends Biotechnol. 1996;14(3):98-105.