オーバーフロー代謝と酢酸生成とは？大腸菌発酵の生産性を落とす壁

不思議なのは、酸素が十分にある好気条件でも起きることです。原因は、糖を完全に酸化しきる呼吸鎖やTCA回路の処理能力に上限があることにあります。取り込んだ炭素のフラックス膜を単位時間・単位面積あたり透過していく流れの量。粘度に反比例し、高濃度で大きく低下する。がこの上限を超えると、あふれた分が酢酸やエタノールへ流れ出ます。つまりオーバーフロー代謝は「酸素が足りないから」ではなく、「処理能力に対して炭素が速く入りすぎるから」起こる、供給と処理のミスマッチなのです。だから正しい問いは「どうすれば一番速く増えるか」ではなく、「菌が炭素を取りこぼさずに酸化できる速さはどこまでか」になります。

本稿は製造プロセスの技術的な解説であり、特定製品の効能を主張するものではありません。臨界となる比増殖速度細胞集団が増える速さの指標。高浸透圧で大きく低下し、比生産性とトレードオフになる。や酢酸が出始める濃度といった数値は、菌株・培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。・装置・スケールに強く依存します。ここで挙げる機序や傾向は範囲として捉え、実際の設計は自社の系での実測とDOEで確定してください。

オーバーフロー代謝とは：あふれ出す炭素

大腸菌にグルコース微生物発酵でエネルギー源となる糖類などの炭素源と、目的遺伝子の発現を促す誘導物質のことです。詳しく →を与えると、通常は解糖系からピルビン酸解糖系で生じる代謝中間体。ミトコンドリアで処理しきれない分が乳酸へ変換される。、アセチルCoAを経てTCA回路で完全に酸化され、多くのATPと二酸化炭素になります。ところがグルコースが過剰にあり、取り込み速度が呼吸鎖・TCA回路の容量を超えると、処理しきれないアセチルCoAがPta-AckA経路を通って酢酸として菌体外へ排出されます。酸素があっても起こるため、好気的酢酸生成（aerobic acetate overflow）とも呼ばれます。

酵母（Saccharomyces cerevisiaeパン・ビール酵母として食経験が長い酵母。遺伝子操作ツールが豊富で、経口・食品関連の用途と親和する。）でも同じ構図が、エタノール発酵という形で現れます。好気であってもグルコース濃度が一定以上になると、呼吸ではなく発酵に代謝が傾き、エタノールを生成します。これがクラブトリー効果です。ワインやビールの醸造ではこの性質が有用ですが、菌体や組換えタンパク質遺伝子組換えで微生物や細胞に作らせた目的タンパク質。宿主により折りたたみやコスト、糖鎖が異なる。を増やしたい発酵では、炭素とエネルギーの浪費であり、生産を妨げる要因になります。

近年の研究では、大腸菌の酢酸生成は単なる酸素不足の代替経路ではなく、限られたタンパク質資源（プロテオーム）を効率的に配分した結果として、速い増殖では発酵的な代謝の方が割に合うために選ばれる、という理解も示されています。いずれにせよ実務上の要点は共通で、速く増やそうとするほど炭素が副産物へ漏れやすい、という点です。

なぜ酢酸・エタノールは生産性を落とすのか

副産物が問題になる理由は、大きく三つあります。

第一に、炭素とエネルギーの浪費です。せっかく与えた糖の一部が菌体にもタンパク質にもならず、酢酸やエタノールとして捨てられます。炭素あたりの菌体・目的物の収率が下がる、直接の原因です。

第二に、増殖と発現の阻害です。とくに大腸菌の酢酸は、一定濃度を超えると比増殖速度を下げ、組換えタンパク質の発現量細胞が目的のタンパク質を作る量。低いと必要量の確保に手間がかかり、製造コストが上がる。も落とすことが繰り返し報告されています。酢酸は弱酸として細胞内へ入り込み、細胞内pHやプロトン駆動力を乱すと考えられています。つまり酢酸は炭素の無駄であると同時に、それ自体が増殖と生産を止める阻害物質でもあります。

第三に、運転と下流培養液から抗体を分離・精製する下流工程。清澄化からProtein A、ポリッシュ、UF/DFまでを指す。への負荷です。酢酸生成はpHを下げるため、中和のためのアルカリ添加が増えます。副産物は培養液の組成を変え、後段の精製で除くべき不純物やストレス要因にもなります。高密度発酵で到達菌体密度が伸び悩む背景には、しばしばこの副産物の蓄積があります。

引き金は基質過剰と高い比増殖速度

副産物を出させる引き金は、突き詰めると「炭素が処理能力に対して速く入りすぎること」に集約されます。具体的には、次のような条件が重なると生じやすくなります。

とりわけ重要なのが比増殖速度 μ です。多くの系には、それ以下なら副産物をほとんど出さずに増える臨界比増殖速度が存在し、μ をこの値以下に保てるかどうかが分かれ目になります。臨界値そのものは菌株・培地・温度で動くため一律には言えませんが、「速く増やす」ことと「副産物を出さない」ことがトレードオフの関係にある、という構図は共通です。回分・流加・連続といった培養様式ごとの特徴は微生物発酵の培養モードで整理しています。

流加培養で基質供給を絞る

副産物を出させない運転の基本は、炭素源を一度に与えず、菌が処理できる速さに合わせて少しずつ供給することです。これを実現するのが流加培養（フェドバッチ種培養で増やした細胞を大型の培養槽に移し、目的物質を本格的に産生させる最終段階の培養です。栄養を追加しながら育てるフェドバッチが広く使われます。詳しく →）です。

典型的には、まず回分（バッチ）相で初期の糖を消費させ、糖が枯れたところで流加相に切り替えます。以降はグルコースを律速に保ちながら供給し続けるため、菌の周囲には常に低濃度の糖しか存在しません。過剰がなくなればオーバーフローも起きにくくなる、という理屈です。

供給の制御には代表的な方式がいくつかあります。目標とする比増殖速度 μ を決め、菌体量の指数的な増加に合わせて供給量を指数関数的に増やす指数供給（exponential feeding）は、μ を臨界値以下に固定できる王道です。ほかに、糖が枯れると溶存酸素が跳ね上がる挙動を使うDO-stat、糖枯渇時のpH上昇を使うpH-statもあります。いずれも「糖を余らせないタイミングで供給する」という目的は同じです。フィードそのものの組み立てや培地との対応は発酵培地とフィード設計で詳しく扱っています。

溶存酸素と比増殖速度をどう管理するか

流加で糖を絞っても、溶存酸素（DO）培養液などに溶け込んでいる酸素の量。細胞培養では制御対象となる重要なパラメータ。が切れれば副産物は出ます。酸素が足りなければ糖を完全に酸化できず、発酵的な経路へ流れてしまうからです。したがって、糖の供給を絞ることと、DOを一定以上に保つことは、常にセットで管理する必要があります。

高密度になるほど菌体あたりの酸素要求（OUR）は跳ね上がり、供給（OTR）が追いつかなくなりがちです。通気・撹拌を強めてkLa小型培養で確立した条件を、より大きなバイオリアクターへ拡大する取り組みです。酸素供給の指標kLaなどを揃え、性能を再現します。詳しく →を確保し、必要なら純酸素の富化や槽内圧の利用でDOを維持します。この酸素供給の作り込みと、スケールを上げたときに現れる基質勾配の問題は微生物発酵のスケールアップで詳しく扱っています。大スケールでは混合が遅れ、フィード添加点の近くだけ糖が濃くなるため、小スケールでは見えなかった局所的な副産物生成が顔を出すことがあります。

比増殖速度 μ の管理は、これらを束ねる制御変数です。μ を上げれば生産は速くなりますが、酸素要求も副産物リスクも一緒に上がります。実務では、μ を臨界値以下の安全域に保ちつつ、DOが下限を割らない範囲で運転する、という綱引きになります。オンラインで基質や副産物を測るPAT主に低分子製造で、化学反応の進み具合(転化率など)を製造中にその場で追跡する手法です。PATとも呼ばれます。詳しく →的な手法を使えば、μ をよりリアルタイムに一定化することも可能です。運転全体の組み立ては微生物発酵の製造解説も参照してください。

宿主株を改良する：作らせない・食べさせる

運転条件の作り込みに加えて、そもそも副産物を出しにくい宿主株を使う、あるいは作るという方向性もあります。

大腸菌では、酢酸排出の主経路であるPta-AckA経路に関わる遺伝子（ptaやackAなど）を改変して酢酸生成を抑える試みが古くからあります。ただし単純に止めると、今度はピルビン酸など別の副産物が溜まることがあり、代謝全体のバランスを見た設計が要ります。また、糖の取り込み速度そのものを穏やかにして、処理能力を超えないようにするアプローチもあります。実用面では、発現用によく使われるBL21系統が、K-12系統にくらべて酢酸を溜めにくいことが経験的に知られており、宿主選択の段階で副産物リスクを下げられる場合があります。

酵母では、クラブトリー効果の強いSaccharomyces cerevisiaeに対し、クラブトリー効果が弱く高濃度グルコースでも発酵に傾きにくいPichia pastoris（Komagataella phaffiiメタノールを炭素源にできる酵母。強力なAOX1誘導と分泌生産に向き、高密度培養で組換えタンパク質を作る。）などのメタノール資化性酵母メタノールを炭素源として利用できる酵母。Pichiaが代表で、この性質をAOX1誘導による生産に活かす。が、組換えタンパク質生産で広く使われます。宿主としての酵母の特徴や使い分けは酵母での組換えタンパク質生産で整理しています。株の改良は運転の工夫と相補的で、どちらか一方ではなく、両輪で副産物を抑えるのが現実的です。

まとめ

オーバーフロー代謝（大腸菌の酢酸、酵母のクラブトリー効果によるエタノール）は、炭素が呼吸・TCA回路の処理能力を超えて速く入るときに、好気条件でも起こる供給と処理のミスマッチです。生じた副産物は炭素とエネルギーを浪費するだけでなく、増殖と組換えタンパク質の発現を阻害し、pHや下流にも負荷をかけます。引き金は基質過剰・高い比増殖速度・酸素不足・大スケールの基質勾配で、対策は一貫して「炭素を処理できる速さで与える」ことに帰着します。流加培養で糖を律速に供給し、指数供給などで比増殖速度 μ を臨界値以下に保ち、DOを切らさない。そのうえで酢酸を出しにくい宿主を選ぶ。これらを両輪で組み合わせることが、微生物発酵大腸菌などの微生物を培養槽で増やし、目的タンパク質などを作らせて回収する製造工程です。詳しく →の生産性を守る要になります。数値は株・培地・装置で動くため、範囲と条件依存として扱い、自社の系での実測を前提に設計してください。

参考文献

主な文献

• Eiteman MA, Altman E. Overcoming acetate in Escherichia coli recombinant protein fermentations. Trends in Biotechnology. 2006;24(11):530-536.
• Basan M, et al. Overflow metabolism in Escherichia coli results from efficient proteome allocation. Nature. 2015;528(7580):99-104.
• Lee SY. High cell-density culture of Escherichia coli. Trends in Biotechnology. 1996;14(3):98-105.
• Riesenberg D, et al. High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate. Journal of Biotechnology. 1991;20(1):17-27.

ガイドライン

• ICH Q11原薬の開発・製造を扱い、原薬側の管理戦略の作り込みを示すICHのガイドライン。, Development and Manufacture of Drug Substances（原薬の開発と製造）