MSC製造とは？ロット間差の課題と継代数による品質低下・特性解析

抗体やワクチンとは前提が違います。構造の決まった分子ではなく、生きた細胞の性質を運ぶ。出発材料はドナーの組織なので、由来組織でも年齢でも個体でも増殖能が変わります。しかも培養を続けるほど細胞は老化し、分化能も免疫調節能免疫細胞の働きを抑えたり調整したりする性質。MSCの作用機序の中心とされる機能の一つです。も動きます。どこまで増やせるかと、性質をどこまで保てるか。この二つの綱引きが、工程設計のほぼ全部を決めます。

本稿では、自家と他家の分かれ目から始めて、出発材料のばらつき、ISCTの最低基準が置いた数字、無血清化、継代の上限、細胞バンクの二層構造、そしてマイクロキャリア培養液中に浮遊させる微小なビーズで、その表面に接着細胞を付着させ、撹拌培養で大量に増やすための担体です。詳しく →での大量製造を整理します。最後に、工程を決める順番を並べます。工程全体の流れはMSCの基準工程マップも参照してください。

自家と他家 ― 力価で測れないものの規格化

製造方式は二つに割れます。患者自身の組織から採って増やし本人に戻す自家と、健常ドナー由来の細胞をあらかじめ大量に作って在庫する他家健常ドナー由来の細胞から在庫型で製造するCAR-T。拒絶やGvHDを避ける改変を要する。詳しく →。1ドナーから多数の患者分を供給できる他家のほうが、製造効率でも供給の安定でも有利です。

問題は品質の測り方にあります。抗体なら結合活性、酵素なら反応速度で強さが定量できる。MSCにはそれがありません。働いているのは分泌するサイトカイン細胞が放出する免疫の情報伝達物質。細胞治療では効果と安全性のリードアウトになる。詳しく →なのか、細胞間の相互作用なのか、作用機序薬が効果を発揮する仕組み。抗体医薬ではADCCやCDCなどが該当し、アッセイで裏づける。詳しく →が一本に絞れないからです。

だから実務では、強さではなく性質を見ます。三系統分化能があるか。決めた表面マーカー細胞表面に出るタンパク質などの目印。MSCではCD73・CD90・CD105の発現などで細胞を見分けます。詳しく →が出ているか。免疫調節能が保たれているか。これらが培養を通じて維持されているかで適格性を判断します。 MSCの品質管理遺伝子治療製品の品質・安全性・有効性を保証するために製造・出荷の各段階で実施する試験・管理の総体。詳しく →は、活性の強さを上げることではなく、規定した性質を製造を通じて保つことに主眼があります。

出発材料のばらつき ― 由来組織とドナー

由来組織は主に三つです。骨髄、脂肪組織、臍帯。

骨髄は穿刺で採るので侵襲がありますが、研究と臨床の蓄積がいちばん長い。脂肪組織は採取量を確保しやすく、細胞の収率も高めとされます。臍帯は出産で出る廃棄組織から得られ、ドナーが若いぶん増殖能が高い傾向を持ちます。

同じ組織でも、ドナーの年齢や既往や個体差で初代細胞の性質はばらつきます。出発材料が揃わない以上、他家製造ではドナーの選定と感染性因子のスクリーニングが品質の起点です。

分離では、コラゲナーゼなどで細胞外マトリックス細胞が自ら分泌し、細胞の周囲を埋めて接着や組織の構造を支える物質の総称。を消化して細胞を遊離させます。使われるのは SERVA の Collagenase NB シリーズ、Roche の Liberase、Worthington Biochemical の各タイプ、Miltenyi Biotec の Tissue Dissociation Kits、STEMCELL Technologies の ACCUMAX あたりです。回収したら、プラスチック面への接着性を使って非接着の細胞を洗い流し、接着して増えてくる集団を初代培養組織から分離した細胞を最初に立ち上げる培養。ドナー差により性質がばらつきやすい段階です。として立ち上げます。出発材料が揃わないことを前提に、ドナー選定と分離条件で素性を揃えるのが他家製造の出発点です。

ISCTの最低基準が置いた数字

MSCと名乗るための最低条件は、2006年に ISCT が position statement として示したものが広く参照されています。三つあります。

一つめはプラスチック面への接着性。二つめが表面マーカーで、ここに具体的な数字が入ります。CD105、CD73、CD90 が 95%以上 陽性で、かつ CD45、CD34表面マーカーCD34を発現する細胞画分。造血幹・前駆細胞が濃縮された指標として採取・選別で用いられる。詳しく →、CD14 または CD11b、CD79α または CD19、HLA-DR が 2%以下。三つめが、骨芽細胞・脂肪細胞・軟骨芽細胞への三系統分化能です。

95%以上 と 2%以下 という線が引かれているのが効きます。定性的な「陽性」「陰性」ではなく、集団の何割かで判定する。測定にはフローサイトメトリー細胞を一つずつ測定し、表面マーカーや性質を調べる手法です。細胞の種類・純度・活性の確認に使います。詳しく →を使い、分化能は誘導培養後の染色で見ます。

免疫調節能のほうは、まだ標準化が進んでいません。T細胞の増殖抑制やサイトカイン分泌を指標とするアッセイが効力試験製品が本来の生物学的な作用をどれだけ発揮するかを測る試験です。有効性を保証するための重要な品質指標です。詳しく →として検討されていますが、作用機序が多面的なので一本に決めきれない。測れる部分には数字の線が引かれていて、測りにくい部分が開発段階の課題として残っています。

拡大培養 ― FBSから無血清・異種成分フリーへ

初代培養から製剤に必要な数まで増やすのが拡大培養遺伝子改変したT細胞を投与に必要な数まで増やす工程。増やしすぎると細胞が疲弊する。詳しく →です。MSCは接着依存性なので、フラスコやセルファクトリーの平面で単層を作りながら増えます。培養面が埋まってきたら解離酵素で剥がし、広い面積へ播き継ぐ。この繰り返しです。剥離には Thermo Fisher Scientific の TrypLE Express や TrypLE Select のような組換え酵素が使われ、容器は Corning、Greiner Bio-One、Thermo Fisher の Nunc、TPP目指す製品の要件をまとめた設計図。ベクター種・用量・投与経路・必要数量などを定め、開発判断の前提になる。詳しく →、Sarstedt あたりが並びます。

培地の選択は、品質と規制の両方に触れます。長らくウシ胎児血清を添加してきましたが、ロット間差、感染性因子の懸念、異種成分の残留という三つが残る。そこで無血清・異種成分フリーの培地へ移る流れが強まりました。ヒト血小板溶解物血小板由来の成長因子を含む培地添加物で、ウシ血清の代わりに細胞の増殖を助けるために加えます。詳しく →を使う方式もあります。FUJIFILM Irvine Scientific の PRIME-XV MSC 培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。詳しく →のような製品が、この用途に置かれています。

無血清化には代償があります。血清が担っていた接着の補助がなくなるので、培養面のコーティングが要ります。Corning の BioCoat、Thermo Fisher の Geltrex、Greiner のポリ-D-リジンやコラーゲン被覆品などです。継代増殖した細胞を定期的に希釈・移植して培養を維持する操作で、回数が増えると細胞の性質が変化するリスクがある。詳しく →の条件も培地ごとに取り直しです。 無血清化は安全性とロット再現性のために進みますが、接着と継代の条件を作り直す工程設計の判断です。

継代の上限をどこに置くか

継代を重ねるほど細胞は老化します。増殖が鈍り、形が大きく扁平になり、分化能も免疫調節能も動きます。増やす量を稼ごうとして継代を伸ばすほど、性質を保つ側のリスクが上がる。

だから使える継代数、あるいは累積の集団倍加数細胞集団が何回倍加したかを表す値。継代数とともに、細胞の使用上限を管理する目安に使われます。に上限を置きます。上限の根拠は、その細胞株で実際に取ったデータです。何継代目でマーカーの陽性率が 95% を割るのか。何継代目で分化能が落ちるのか。報告では、臨床用のMSCを4継代から6継代あたりで止める運用や、累積の集団倍加数を 20〜25 世代 に置く運用が見られますが、これは目安であって基準ではありません。他社の数字を持ってきても当たりません。

上限を決めるとき、起点をどこに取るかを忘れないでください。初代培養からの通算なのか、バンクからの通算なのか。次節の細胞バンクが、この起点を与えます。継代の上限は増殖能ではなく、性質が保たれている範囲から決まります。

MCBとWCB ― 素性を固定する二層

他家製造を支えるのが、二層の細胞バンクです。

選んだドナー由来の細胞を増やして均一化し、まとめて凍結したものがマスターセルバンク。その一部を解凍してさらに拡大し、製造ごとに取り崩す在庫がワーキングセルバンク製造の起点となる細胞を段階的に均質に凍結保存した在庫（マスター/ワーキングセルバンク）。詳しく →です。製造のたびに新しいドナー組織から立ち上げるのではなく、特性解析規格試験より高い分解能で製品の品質特性を詳しく調べること。比較可能性の評価などで用いる。詳しく →を済ませたバンクから始める。これでロット間の一貫性が取れます。

マスターセルバンクに紐づくのは、同一性、無菌性、感染性因子の否定、そして特性解析の結果です。ワーキングセルバンクでは、解凍後の性質と無菌性を見ます。継代数細胞を植え継いだ回数。培養履歴を表し、産生量や品質の再現性に影響する。詳しく →はマスターセルバンクからの通算で数え、各ロットがそこから何代目かを記録します。

凍結にも作り込みが要ります。DMSO を含む凍結保存液で細胞を守り、制御速度で凍結し、液体窒素の気相、おおむね -150 ℃ 以下で保管する。凍結速度は毎分 1 ℃ 前後を狙うのが定石です。BioLife Solutions の CryoStor のような製品と、制御速度凍結機冷却速度を制御しながら細胞をゆっくり凍らせ、凍結による損傷を抑える装置。詳しく →を組み合わせます。解凍後に性質が戻るかどうかまでが、バンクの適格性の一部です。 二層のバンクは、ドナー由来のばらつきを上流で固定すると同時に、継代数を数える基準点を与えます。

マイクロキャリアと収穫

他家で多数の患者分まで増やすには、平面培養を積み増すだけでは面積も手間も無菌操作外部から微生物を入れずに工程を進める操作。最終滅菌できない細胞治療では全工程で無菌性を維持する。詳しく →も限界に来ます。そこで接着面を球状の担体カラムに充填する多孔質ビーズ。表面のリガンドと成分の相互作用差で目的物と不純物を分離する。詳しく →に置き換えます。

数字で見ると効果が分かります。Cytiva の Cytodex 1 は乾燥重量 1 g あたり 4,400 cm² の培養面積を持ち、粒子の数にして 4×10⁶ 個ほど。Cytodex 3 は 2,700 cm² です。T-175 フラスコを何十枚も並べる代わりに、撹拌槽撹拌翼で機械的に混ぜ、スパージャーで通気する最も標準的なバイオリアクターの型式。詳しく →の中に同じ面積を溶かし込める計算です。槽の側は Eppendorf の BioBLU c、PBS Biotech の Vertical-Wheel、Sartorius の Biostat といった構成が使われます。

そのかわり管理点が増えます。撹拌と通気による剪断応力。ビーズ間を細胞が移動すること。そして収穫です。収穫では、もう一度解離酵素で細胞をビーズから剥がし、ビーズと細胞を分けて回収します。ここで細胞を傷めれば、それまでの工程が無駄になる。分離と洗浄には Sartorius の kSep のような向流遠心向流遠心などを使って細胞を洗い、余分な液を除いて濃く集める(濃縮する)装置です。詳しく →装置が使われます。

平面で決めた条件が、そのまま撹拌槽で成り立つとは限りません。 マイクロキャリアで増える量が稼げても、剪断と収穫で性質が保てなければ、スケールアップ小型培養で確立した条件を、より大きなバイオリアクターへ拡大する取り組みです。酸素供給の指標kLaなどを揃え、性能を再現します。詳しく →は成立しません。

工程を決める順番

最後に、順番を並べます。

先に決まるのは、何を性質として規格に置くかです。表面マーカーの陽性率、三系統分化能、そして効力試験に何を使うか。ここが決まらないと、継代の上限も無血清化の合否も判定できません。効力試験は標準化が進んでいない領域なので、早い段階から当局と相談しておきます。

次にドナーと由来組織を決めます。骨髄か脂肪か臍帯か。他家なら、選定とスクリーニングの基準をここで固めます。素性が決まって初めて、バンクが作れます。

そのうえで培地を選び、継代の条件を取り直します。無血清へ行くなら、接着のコーティングと剥離の酵素と播種密度が一緒に動きます。 培地だけを差し替えて、継代条件を前のままにすると、増えないか、増えても性質が変わります。

最後に継代の上限を、自社の細胞で測って決めます。何代目でマーカーが基準を割るか、何代目で分化能が落ちるか。そしてスケールアップの前に、収穫後の細胞で同じ項目を測り直します。 平面で決めた上限は、撹拌槽ではそのまま使えません。

参考文献

ガイドライン・基準

• ISCT (International Society for Cell & Gene Therapy) — Mesenchymal Stromal Cell Committee. https://www.isctglobal.org/about/isct-committees/msc
• FDA Guidance for Industry: Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products（米国食品医薬品局）
• EMA — Guideline on human cell-based medicinal products（EMEA/CHMP/410869/2006、欧州医薬品庁）https://www.ema.europa.eu/en/human-cell-based-medicinal-products-scientific-guideline

主な文献

• Dominici M, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317. PMID: 16923606. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16923606/
• Le Blanc K, et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 2008;371(9624):1579-1586. PMID: 18468541. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18468541/
• Galipeau J, Sensébé L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 2018;22(6):824-833. PMID: 29859173. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29859173/
• Viswanathan S, et al. Mesenchymal stem versus stromal cells: International Society for Cell & Gene Therapy (ISCT) Mesenchymal Stromal Cell committee position statement on nomenclature. Cytotherapy. 2019;21(10):1019-1024. PMID: 31526643. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31526643/