細胞治療の凍結保存とコールドチェーンとは？なぜ冷やすだけでは不十分か

細胞治療の凍結保存とコールドチェーン製品を凍結・低温のまま保管・輸送する仕組み。細胞治療では生細胞率の維持に直結する。詳しく →とは、細胞を凍らせ、極低温で保管・輸送し、解凍して投与するまでを途切れずに管理することです。細胞そのものが医薬品なので、製造、品質保証、物流のどの担当にとっても、投与の時点で細胞が生きて働くかを左右します。

ただし、冷やせば守れるとは限りません。凍る過程そのものが細胞を傷つけ、保管・輸送・解凍のどこか1つが崩れても、届いた細胞は無傷とは言えなくなります。

この記事では、鎖の4つの段、冷やすだけでは足りない理由、保管と輸送で守る温度、解凍後に見るもの、自分の場合に決める順番を順に説明します。

1. 細胞治療の凍結保存とコールドチェーンとは、どこからどこまでの管理なのか？

細胞治療の凍結保存生きた細胞を低温で止めて保管し、後で融解して使えるようにする技術。詳しく →とコールドチェーンとは、凍結・保管・輸送・解凍の4つの段を、細胞が傷まない条件でつなぐ管理です。

冷蔵で運べる抗体医薬と違い、細胞治療生きた細胞そのものを有効成分とする医薬。CAR-Tなどが代表。詳しく →の製品はマイナス150℃近くまで冷やしたまま運びます。投与されるときに、細胞が生きた状態で戻らなければならないからです。

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• 凍結⁠：保護剤を加えた液に細胞を入れ、決めた速さで温度を下げます。
• 保管⁠：液体窒素タンクで、極低温のまま出荷まで置きます。
• 輸送⁠：極低温を保つ専用の容器で、製造拠点から投与施設へ運びます。
• 解凍⁠：短時間で氷を溶かし、決めた時間内に投与します。

4つの段は担当が分かれていても、傷みは段をまたいで積み重なります。つまり、どれか1つの段の仕様だけを見ても、届いた細胞の状態は判断できません。

2. 重要：なぜ、冷やすだけでは細胞を守れないのか？

冷やす速さが遅すぎても速すぎても、細胞は別々の傷害を受けるからです。

細胞を冷やすと、まず細胞の外の水が凍ります。氷ができると周りの溶質が濃くなり、細胞内の水が外へ引き出されて、細胞は脱水で傷みます。逆に速く冷やすと、水が出ていく前に細胞の中で氷の結晶ができ、膜が壊れます。

この相反を整理したのが、Mazur らの二要因仮説凍結時に溶液効果による傷害と細胞内氷晶による傷害が両立し、最適冷却速度が存在するとする説。詳しく →（1972年）です。細胞ごとに両方の傷害が最小になる冷却速度がある、という考え方で、凍結の条件づくりはその速度を探す作業です。

保護剤のDMSOは、なぜ濃くするほどよいとは言えないのか

速度の許容範囲を広げるのが、凍害保護剤凍結時の氷晶や浸透圧ストレスから細胞を守る添加剤。DMSOが代表的。詳しく →です。代表のDMSO（ジメチルスルホキシド）は細胞の中に入り、氷の成長を抑えます。細胞治療では5〜10%ほどのDMSOを含む凍結保存液が広く使われ、キメラ抗原受容体（CAR）を持たせたT細胞（CAR-T患者や健常ドナーのT細胞にCAR（キメラ抗原受容体）を導入し、がん細胞を攻撃させる細胞治療。詳しく →）の承認品でも、5%の製品と7.5%の製品があります（CAR-Tの凍結製剤）。

一方で、DMSOは投与時の悪心や血圧の変動、心血管系の反応と結びつくことが知られています。洗って除くと、今度は洗浄で細胞が傷み、回収率も落ちます。施設によって使う量も洗浄の有無もばらつくと報告されています。

設定した速さは、なぜそのまま実現しないのか

速さを制御するのがプログラムフリーザーで、多くの製品では毎分1℃前後でゆっくり下げます。ただし、凍る温度を下回っても液体のままだった水が一気に凍る瞬間に熱（潜熱）が出て、サンプルの温度が跳ね上がります。設定が毎分1℃でも、実際の温度の履歴は別物になりえます。そこで、この発熱を打ち消す急冷の段をプロファイルに入れます。

容器の形も温度の下がり方を変えます。患者1人分を入れる凍結バッグ液体窒素レベルの極低温での凍結保存に使う使い捨てバッグです。細胞や原薬を凍らせて長期に保管・輸送するための容器です。詳しく →と、少量ずつ分ける凍結バイアルでは、同じ設定でも実測の履歴が違います。このように、凍結の条件は設定値でなくサンプルの実測で、容器ごとに検証することが前提です。

3. 保管と輸送では、なぜマイナス130℃より低く保つのか？

マイナス130℃前後のガラス転移の温度を上回ると、保管中に氷の結晶が育ち直し、細胞が傷むからです。

ガラス転移とは、水が結晶にならずにガラスのように固まる温度です。この温度より低ければ、分子はほとんど動けません。冷凍庫の食品は霜で少しずつ傷みますが、ここではその変化がほとんど進みません。

保管はなぜ液相ではなく気相なのか

保管には液体窒素保存タンクを使い、液体に浸けずにタンク上部の窒素ガスの層（気相）に置きます。液体に浸けると、バッグの破損部やバイアルのねじ部から液体窒素が入り込み、ほかの検体の病原体を持ち込む経路になりえるからです。

気相の代わりに難しくなるのが、温度の均一さです。タンクの上部ほど温まりやすく、ほかの検体を出し入れするたびに隣の製品が一時的に温まることもあります。短い温度上昇が品質にどれだけ響くかは報告がまだ限られていますが、記録に残らない温度上昇を許す根拠にはなりません。

そのため、全段のマッピング、連続の温度監視、液面の警報、自動補充を運用の要件にします（超低温フリーザーの温度マッピング）。

警報が効かないと何が起きるかを示す事例があります。2018年、米国の不妊治療クリニックで保存タンクが故障し、約3,500個の凍結卵子と胚が失われました。2021年の陪審は、タンクの欠陥と、液面を監視する制御装置の不具合をメーカーがリコールしなかった過失を認めています。

輸送はなぜドライアイスでは足りないのか

ドライアイスの温度は約マイナス78℃で、ガラス転移の温度よりずっと高いからです。短距離なら成り立つ場合もありますが、長距離の輸送には足りないことが多いと考えられています。

そこで主流になっているのが、液体窒素を吸着材に含ませて気相の環境を作る二重壁の容器（ドライシッパー多孔質材に液体窒素を含ませ、自由液を持たずに気相の超低温を数日から2週間ほど保つ輸送容器。詳しく →）です。電源なしに、容器と条件によって数日から1週間以上、極低温を保ちます。選ぶときは「バリデート済み」の中身として、輸送時間、外気温、横倒しの姿勢、振動のどこまでを試験したかと、自社のルートの最長の遅れを見込んだ保持時間かを確かめます。

つまり、保管と輸送の品質は、極低温を保てるかに加えて、温度が外れたことを記録で捕まえられるかで決まります。

4. 解凍した細胞は、生存率だけで確かめてよいのか？

解凍後は生存率に加えて、増える力やサイトカイン細胞が放出する免疫の情報伝達物質。細胞治療では効果と安全性のリードアウトになる。詳しく →を出す力といった細胞の機能まで確かめます。

生存率が規格を満たしていても、細胞が無傷とは限らないからです。CAR-Tの研究では、製造の途中で凍結しても、最終製品の増え方、遺伝子の導入効率、臨床での反応に大きな影響はなかったとされます。その一方で、凍結と解凍のあとに、細胞の自死（アポトーシス細胞が遺伝的プログラムに従って自発的に死に至る過程で、壊死とは異なり膜の完全性が初期段階では保たれる。詳しく →）に関わる印の上昇といった細かなストレスも観察されたと報告されています。

解凍の手順も結果を変えます。一般には37℃前後の水浴か、乾式の解凍装置で短時間に氷を溶かし、溶ける途中で氷が育ち直すのを避けます。溶けたあとはDMSOの毒性が時間とともに効くので、決めた時間内に投与するか、洗浄します。

冷却と解凍の速さは、組み合わせで効きます。T細胞での報告では、冷却が毎分1℃以下なら、調べた範囲で解凍速度の影響は小さく、速く冷やした場合は解凍速度の影響が大きくなるとされます。

解凍の評価は、凍結の条件とひと組みです。冷却の条件を変えたら、解凍の手順と評価も見直します。

5. 自分の場合は、何から確かめるのか

最初に、製品が自家（患者本人の細胞）か他家（ドナーの細胞）かを確かめます。 鎖のどこを厚く守るかが、それで変わるからです。

自家は患者1人分を1つのバッチで作るので、製造から投与までを最短でつなぐ時間の管理が中心です。1ロットが1人の治療の機会そのもので、1か所の失敗が取り返せません。他家は1ドナーから多くの投与単位を作り、凍結して在庫を持てるため、長期保管中の安定性と、バッグやバイアルの単位での追跡が中心です（自家と他家の違い）。

そのうえで、次の順に決めます。プロファイルは容器に付くので、容器を後から変えると検証をやり直します。

• 容器を決める⁠：凍結バッグか凍結バイアルかを、自家か他家かに合わせて選びます。バッグは低温でフィルムが脆くなるので、保護の手順も一緒に決めます。
• 保護剤のDMSO（ジメチルスルホキシド）の濃度と洗浄の有無を決める⁠：投与時の負荷と、洗浄での細胞のロスを並べて決めます。
• 冷却のプロファイルを実測で確かめる⁠：設定値ではなくサンプルの温度で、潜熱の補償まで確かめます。
• 保管タンクと輸送容器の条件を決める⁠：タンクのマッピング、監視、液面の警報、自動補充と、止まったときの対応を決めます。輸送容器は、ルートの最長の遅れを見込んだ保持時間かを確かめます。
• 温度が外れたときの出荷判定製造したロットを規格に照らして出荷の可否を決める判断。有効期間の短い製品では時間との戦いになる。詳しく →を文書にする⁠：逸脱承認された手順や規格から外れた事象。GMPでは発見したら記録し、製品品質への影響を評価してロットの可否を判断します。詳しく →が起きる前に決めておきます。生きている製品を前にしてから判断を考えても、間に合いません。
• 解凍後の評価項目を決める⁠：生存率に加えて、増える力などの機能を入れます。

これらを製造委託先やメーカーに聞くと、凍結・保管・輸送・解凍のどの段の説明が足りないかが分かります。保存液や容器、装置は、下の製品ガイドで比べられます。

参考文献

• Mazur P, Leibo SP, Chu EH. A two-factor hypothesis of freezing injury. Evidence from Chinese hamster tissue-culture cells. Exp Cell Res. 1972;71(2):345-355. PMID: 5045639. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/5045639/
• Hubel A. Parameters of cell freezing: implications for the cryopreservation of stem cells. Transfus Med Rev. 1997;11(3):224-233. PMID: 9243775. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9243775/
• Windrum P, Morris TC, Drake MB, et al. Variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: a survey of EBMT centres. Bone Marrow Transplant. 2005;36(7):601-603. PMID: 16044141. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16044141/
• Baboo J, Kilbride P, Delahaye M, et al. The Impact of Varying Cooling and Thawing Rates on the Quality of Cryopreserved Human Peripheral Blood T Cells. Sci Rep. 2019;9(1):3417. PMID: 30833714. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30833714/
• Panch SR, Srivastava SK, Elavia N, et al. Effect of Cryopreservation on Autologous Chimeric Antigen Receptor T Cell Characteristics. Mol Ther. 2019;27(7):1275-1285. PMID: 31178392. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31178392/
• Elmoazzen H, Howell, Pasha, et al. Transient Warming Events in Cord Blood Units and the Impact on Product Quality（Cord Blood Connect 2018 の学会抄録）. Stem Cells Transl Med. 2018;7(Suppl 1). https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6123768
• NBC News, $15M awarded to five people who lost eggs, embryos at fertility clinic（2021年。Pacific Fertility Center の2018年の保存タンクの故障と陪審の評決）
• USP米国で医薬品・原料・試験法の公式基準を定める公定書で、製薬用水に関する規格も収載されている。詳しく → General Chapter 〈1044〉 Cryopreservation of Cells（本文は有償の USP-NF に収載）