iPS細胞の分化誘導とは？同じ手順でも結果がばらつくのはなぜか

iPS細胞体細胞を初期化して作る多能性幹細胞。同一株から繰り返し分化・製造でき均質性を高めやすい。詳しく →の分化誘導幹細胞を、発生過程を模した因子の切り替えによって神経・心筋など目的の細胞へ段階的に方向づける操作。詳しく →とは、iPS細胞を、移植に使う神経・心筋・網膜の細胞などへ変える工程のことです。再生医療等製品は、この工程で得た細胞から製造します。製造では手順を、品質管理原料・資材・中間体・製品を規格に照らして試験し、使ってよいか、出荷してよいかの合否を決める仕事です。GMPでは製造部門から独立させます。詳しく →では試験方法を決める必要があります。

厄介なのは、同じ手順で分化させても結果がそろわないことです。目的の細胞が得られる割合は、使う株（iPS細胞の系統）や、分化を始めるときの細胞の状態によって変わります。

この記事では、細胞が分化する仕組み、結果がばらつく理由、得られた細胞の確かめ方を順に説明します。

1. iPS細胞の分化誘導とは、細胞の何を変える工程なのか？

iPS細胞の分化誘導とは、体の中で細胞ができる順番を培養皿で再現し、段階ごとに薬剤を切り替えて目的の細胞へ進ませる工程のことです。 細胞の数を増やすための培養と違い、分化誘導は細胞の性質そのものを変えます。

出発材料のiPS細胞（人工多能性幹細胞さまざまな細胞へ分化できる能力を持つ幹細胞。オルガノイドなどの出発材料になる。詳しく →）は、皮膚や血液の細胞に遺伝子を導入して、体のさまざまな種類の細胞になれる状態に戻した細胞です。まだ特定の細胞になっていないこの状態を、未分化と呼びます。iPS細胞は未分化のまま、継代増殖した細胞を定期的に希釈・移植して培養を維持する操作で、回数が増えると細胞の性質が変化するリスクがある。詳しく →（増えた細胞を分けて新しい容器に播き直すこと）を重ねて増やせます。

ただし、患者に移植するのはiPS細胞ではありません。分化させたあとの細胞です。パーキンソン病ならドパミン神経前駆細胞（ドパミンを放出する神経細胞になる手前の細胞）、心不全なら心筋の細胞を使います。加齢黄斑変性などの目の病気では、網膜色素上皮網膜の外側にある色素を持つ上皮細胞。iPS細胞からの分化誘導で作られ、再生医療での臨床応用が進む系統。詳しく →（網膜の外側で、光を受ける細胞を支える1層の細胞）を移植する臨床研究が行われてきました（Mandai M, et al. 2017）。

2026年3月6日には、他人のiPS細胞から作った重症心不全向けの心筋細胞シートと、パーキンソン病向けのドパミン神経前駆細胞が、日本で条件及び期限付きの承認を受けました。

下の図は、iPS細胞が途中の段階を通って、心筋・神経・網膜色素上皮の3種類の細胞へ進む道筋を示したものです。

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このように、移植に使う細胞の製造は、iPS細胞を未分化のまま増やす段と、目的の細胞へ進ませる分化誘導の段に分かれます。

2. iPS細胞はどうやって心筋や神経の細胞に変わるのか

iPS細胞は、体の中で細胞ができるときと同じ途中の段階を、1つずつ順に通ることで心筋や神経の細胞に変わります。 だから薬剤は、1種類を加えたままにしません。段階ごとに、加えるものを切り替えるのが基本です。

まず、目的の細胞の前段階となる胚葉へ進ませます。心筋なら中胚葉（心筋や血管、血液のもとになる段階）、神経なら外胚葉（神経や網膜、皮膚のもとになる段階）です。

段階を進めるきっかけは、細胞が受け取る信号（シグナル）です。体の中では、周りの細胞が分泌するタンパク質がこの信号を伝えます。培養では、薬剤を加えて信号を活性化したり阻害したりします。

• 心筋⁠：Wntシグナル（細胞がどの種類になるかを決める信号の1つ）を使います。最初の1日だけWntシグナルを活性化して中胚葉へ進め、3日目からWntシグナルを阻害すると、心筋へ進む細胞が増えます。この順で薬剤を与えた報告では、14日ほどで80〜98%の細胞が心筋になりました（Lian X, et al. 2012、2013）。
• 神経⁠：iPS細胞を未分化のまま保ったり、神経以外の細胞へ進ませたりする2つの信号を、同時に阻害します。どちらも細胞内ではSMADというタンパク質が伝達するため、この方法はデュアルSMAD阻害と呼ばれます。11日ほどで大半の細胞が神経前駆細胞になり、そのあと部位を決める信号を加えると、ドパミン神経などへ進みます（Chambers SM, et al. 2009）。
• 網膜色素上皮⁠：臨床応用を目指した報告では、分化を始めて約3週間で、色素を持つ細胞の集団が現れました。その集団を選び出して増やし、シートにして使います（Kamao H, et al. 2014）。

何を、どの順番で与えるか。ここまでは研究で分かっていて、手順書作業の手順を定めた文書。品質システムの要素を具体化し、査察でも運用が確認される。詳しく →に書けます。難しいのは、濃度と切り替えの時期です。

例えばWntは、同じ信号でも、活性化する時期によって役割が変わります。心筋の分化手順をまとめた報告は、Wntシグナルを活性化する薬剤にCHIR99021を使い、分化はWntシグナルを切り替える時期に非常に敏感だと注意しています（Lian X, et al. 2013）。つまり、手順書があっても、その濃度と時期が自分の細胞に合うかどうかは、まだ分かりません。

3. 重要：なぜ同じ方法で培養しても結果が違うのか？

同じ方法で培養しても結果が違うのは、株ごとに薬剤の効き方が違い、分化を始めるときのiPS細胞の状態もそろわないためです。 株とは、iPS細胞を作ったときに1つの系統として選び、そこから増やしてきた細胞の集まりのことです。同じ提供者の細胞からでも、別に作れば別の株として扱います。

• 株ごとの効き方の違い⁠：分化のしやすさは株によって違います。28株のiPS細胞を肝細胞へ分化させて比べた研究では、効率の差の多くが、細胞を提供した人の違いで説明されました（Kajiwara M, et al. 2012）。
• 分化を始めるときの細胞の状態⁠：未分化のまま増やす段階で、培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。詳しく →や基材（細胞が付着する足場）、継代のやり方がずれると、分化を始める時点の細胞の密度や状態がそろいません。神経の報告では、最初に播いた細胞の密度によって、中枢神経へ進む細胞と、それ以外の系統（神経堤と呼ばれる、末梢神経や色素細胞などのもと）へ進む細胞の割合が変わりました（Chambers SM, et al. 2009）。

この2つが重なると、同じ薬剤を同じ日に加えても、目的の細胞になる割合は株ごと、培養のバッチごとに変わることがあります。例えば先の心筋の報告では、試した6株でWntシグナルを活性化する薬剤の最適な濃度はどれも12 µMでした。それでも著者らは、ほかの株では反応が違うことがあるとして、6〜14 µMの範囲で試すよう勧めています（Lian X, et al. 2013）。

では、何から固めればよいのか。未分化を保つ段階では、組成の分かる基材と培地で条件を固定しておくことが大切です。臨床用の細胞を作る方法としては、組換えのラミニン511 E8断片（細胞が付着するタンパク質の一部を、遺伝子組換えで作ったもの）を基材にし、動物由来の成分を含まない培地で増やす方法が報告されています。この方法なら、細胞を単一細胞に分散させ、数を数えてから播けます。播く細胞の数をそろえられます（Nakagawa M, et al. 2014）。

株を替えれば、薬剤の濃度、播く密度、切り替えの時期の条件出しは、最初からやり直し。株を決めてから条件を検討するのが、手戻りのいちばん少ない順序です。

4. 得られた細胞が目的の細胞かは、どのマーカーで確かめるのか？

得られた細胞が目的の細胞かは、その細胞に特有のタンパク質を持つ細胞の割合で確かめます。 この目印となるタンパク質がマーカーです。細胞数や生存率の測定とは違い、どの細胞になったかを数えます。

心筋なら、心筋の収縮に働く心筋トロポニンT（cTnT）を持つ細胞の割合を、フローサイトメトリー細胞を一つずつ測定し、表面マーカーや性質を調べる手法です。細胞の種類・純度・活性の確認に使います。詳しく →で測ります（Lian X, et al. 2013）。フローサイトメトリーは、蛍光で標識した抗体を細胞に結合させ、細胞を1つずつ流して光る細胞を数える方法です。

神経前駆細胞では、PAX6というタンパク質がマーカーとして使われます（Chambers SM, et al. 2009）。マーカーを持つ細胞の割合は、分化の日数とともに変わります。何日目に測った値かも、一緒に記録します。心筋の拍動や網膜色素上皮の色素のように、形や働きでも分化の進み方を確かめられます。

目的以外の細胞が混ざる場合は、純化で減らします。残存する未分化iPS細胞の量は、別の試験で確かめます。2026年3月に承認された2品目でも、腫瘍形成のリスクへの対応として、製造工程に未分化のiPS細胞についての規格値が設けられました（厚生労働省 2026）。方法はiPS細胞由来の細胞の純化と未分化細胞の検出で、培養中に起きるゲノムの変化はiPS細胞の核型解析で詳しく扱います。

このように、確かめる項目は目的の細胞の割合だけではありません。自分の工程で、どの項目をどの順番で確かめるかを先に決めておきます。

5. 自分の工程では、分化を始める前の何から確かめるか？

自分の工程では、分化を始める前に決まるものから順に、次の5つを確かめます。

• 株⁠：使う株を決める。製造に使う細胞を同じ時点でまとめて凍結保存生きた細胞を低温で止めて保管し、後で融解して使えるようにする技術。詳しく →するセルバンクを作る前に決めておけば、株を替えて条件出しをやり直す事態を避けられます。
• 未分化を保つ条件⁠：基材・培地・継代のやり方を固定し、分化を始めるときに播いた細胞の密度と、それまでに増やした期間を記録する。
• 濃度と切り替えの時期⁠：その株で、薬剤の濃度と切り替えの時期を振り直した記録があるか。手順書やキットの値は、ほかの株で決めた出発点にすぎません。
• 目的の細胞の割合⁠：どのマーカーを、分化の何日目に、どの方法で測るかを決め、株や培養の回の間で比べられるようにする。
• 残存未分化細胞iPS細胞などに由来する製品で、分化しきらず腫瘍化する恐れのある細胞が残っていないか調べる安全性評価です。詳しく →とゲノム⁠：純化の方法と、残存する未分化iPS細胞の検出法を決める（純化と未分化細胞の検出）。ゲノムを調べる継代と方法も、あわせて決めておく（核型解析とゲノム安定性）。

株と未分化を保つ条件が変われば、薬剤の濃度と目的の細胞の割合も測り直します。

マーカーの測定に使う試薬は分化誘導・分化能評価試薬で比べられます。細胞治療生きた細胞そのものを有効成分とする医薬。CAR-Tなどが代表。詳しく →の品質試験の全体は、細胞治療の品質管理（CQA）にまとめました。

参考文献

• Lian X, Hsiao C, Wilson G, et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(27):E1848-E1857.（Wntを最初に働かせ、あとで止める順で、複数の株から最大98%の心筋）
• Lian X, Zhang J, Azarin SM, et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 2013;8(1):162-175.（14日で80〜98%、最初の24時間にCHIR99021、3日目からWntの阻害剤。6株で12 µMが最適、ほかの株は6〜14 µMで試す推奨。播く密度の最適化、切り替えの時期への敏感さ、cTnTのフローサイトメトリー）
• Chambers SM, Fasano CA, Papapetrou EP, et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 2009;27(3):275-280.（2種類の阻害剤によるデュアルSMAD阻害。11日でPAX6を持つ細胞が大半。播いた密度で中枢神経と神経堤の割合が変わる。SHHとFGF8でドパミン神経へ）
• Kamao H, Mandai M, Okamoto S, et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2014;2(2):205-218.（分化開始から約3週間で色素を持つ細胞の集まり。選び出して増やし、シートにする）
• Kajiwara M, Aoi T, Okita K, et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(31):12538-12543.（28株の肝細胞への分化の比較。差の多くは提供者の違い）
• Nakagawa M, Taniguchi Y, Senda S, et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 2014;4:3594.（組換えラミニン511 E8断片と動物由来成分を含まない培地。単一細胞にばらして数を数えて播ける）
• Mandai M, Watanabe A, Kurimoto Y, et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 2017;376(11):1038-1046.（iPS細胞から作った網膜色素上皮のシートを、加齢黄斑変性の患者に移植した臨床研究）
• 厚生労働省, 上野大臣会見概要（2026年3月6日）（iPS細胞を用いた再生医療等製品2品目の条件及び期限付き承認）
• 厚生労働省 医薬局医療機器審査管理課, 再生医療等製品3品目の条件及び期限付承認について（中医協 総-11-2、2026年4月8日）（ヒト（同種）iPS細胞由来心筋細胞シートとラグネプロセルの品目の概要。期限7年。腫瘍化リスクへの対応として、製造工程に未分化iPS細胞についての規格値を設定）