低エンドトキシン回収（LER）とは？エンドトキシンが「見えなくなる」現象
低エンドトキシン回収（LER）とは何か
低エンドトキシン回収（LER：Low Endotoxin Recovery界面活性剤とキレート剤を含む製剤で、時間経過とともに添加エンドトキシンが検出できなくなる現象。）は、製剤にわざと加えた（スパイクした）エンドトキシンが、時間の経過とともにエンドトキシン試験微生物そのものでなく、グラム陰性菌由来の発熱性物質エンドトキシンの量を測る試験。で検出できなくなる現象です。実際にはエンドトキシングラム陰性菌の外膜由来の発熱性物質（LPS）で、注射剤では厳しく管理し、LAL試験などで測定します。詳しく →がそこに存在するのに、試験の見かけ上は「ほとんど回収されない（＝検出値が低い）」——だから“Low Endotoxin Recovery（低回収）”と呼ばれます。
エンドトキシンは、エンドトキシンとはで解説したとおり、注射剤で厳しく管理される発熱性物質です。その定量にはLAL試験（BET：Bacterial Endotoxins Test製品中のエンドトキシンを検出・定量するバクテリアエンドトキシン試験の総称。）が広く使われます。LER界面活性剤とキレート剤を含む製剤で、時間経過とともに添加エンドトキシンが検出できなくなる現象。は、このLAL試験が特定の製剤製剤。原薬を処方・充填して、最終的な投与形態に仕上げた製品。条件下で過小評価してしまうという、品質管理遺伝子治療製品の品質・安全性・有効性を保証するために製造・出荷の各段階で実施する試験・管理の総体。上の見落としリスクとして問題になりました。
LERの怖さは「汚染を見逃す」方向に間違えること。もし製品が本当にエンドトキシンに汚染されていても、LERが起きる製剤では試験値が低く出てしまい、不適合を検出できないおそれがあります。だから当局は、界面活性剤を含むバイオ医薬品でLERの有無を確かめることを求めています。
なぜ起きるのか：マスキングの仕組み
LERの引き金になるのは、多くのバイオ医薬品抗体・タンパク質・核酸など生体由来の分子を利用して製造された医薬品の総称。製剤に共通する組み合わせです。
- キレート剤金属イオンをつかまえるキレート剤。グラム陰性菌の外膜を不安定化させ溶解を助ける。：クエン酸塩やや広い酸性域で緩衝でき金属キレート性も持つが、注射時に刺激が出る場合がある緩衝剤。やリン酸塩中性付近で強く緩衝する一方、凍結時にpHが大きくシフトすることで知られる緩衝剤。などの緩衝剤。金属イオンを掴まえる働きがあります。
- 界面活性剤タンパク質の凝集や容器壁への吸着を防ぐため製剤へ少量加える添加剤で、細胞培養で細胞を保護する目的でも使われます。詳しく →：ポリソルベート20／80など。タンパク質の凝集を防ぐために広く使われます。
エンドトキシン（リポ多糖：LPS）は、水中で分子どうしが集まった“超分子構造（会合体）複数の分子が非共有結合的に集合してできる高次の集合体で、LPSが水中でミセルや多重膜小胞などの形でとる構造的な状態を含む概念。”をとります。キレート剤が構造を安定させている金属イオン（マグネシウムなど）を奪い、そこへ界面活性剤が働くと、LPSの会合状態が変化し、LAL試薬の起点である第一因子（Factor CLAL反応カスケードの最上流に位置するセリンプロテアーゼで、エンドトキシン（LPS）またはβ-グルカンによって活性化される酵素（因子C・因子Gを介した活性化を受ける）。）に結合しにくくなると考えられています。結合できなければLALの反応カスケードが進まず、検出値が下がる——これが「マスキングLPSの会合状態が変化し、発熱性の中心が試薬に認識されなくなる状態。LERの正体。（覆い隠し）」の実体です。
この変化は一瞬では起きず、時間をかけて進むのが特徴です。作りたてでは正常に検出できても、数日置くと回収率添加した既知量の標準物質に対して試験で実際に測定された値の割合を示す指標で、試験の正確さを表す。が落ちていく。しかも室温のほうが2〜8℃よりも速く進むことが知られています。だからこそ、「時間軸」で確かめる試験が要ります。
どう確かめるか：ホールドタイム試験
LERの有無は、エンドトキシンマスキングのホールドタイム試験製剤に標準エンドトキシンを添加して保管し、複数時点で回収率を追ってLERを見つける試験。で確認します。基本の流れはシンプルです。
- 希釈していない実際の製剤（あるいはそれを模した組成）に、既知量のエンドトキシン（標準品力価の基準に定めた品。検体と同じアッセイで並べて測り、相対力価の基準にする。）をスパイク既知量の基準物質を試料に添加すること。質量分析のシグナルを濃度に結びつけてHCPを定量するために行う。する。
- 決めた温度条件（室温、必要なら2〜8℃）で一定期間ホールド（保持）する。数日〜2週間程度をとり、7日間の保持で判定できることが多いとされます。
- 途中の複数の時点で回収率を測り、時間とともに検出値がどう変化するかを追う。
一定の基準（たとえば回収率50%を下回る）を割り込めば、その製剤はLERを示す、と判断します。ここで見ているのは、バイオバーデンとエンドトキシンの違いでいうエンドトキシン管理そのものが、製剤条件で歪まないか、という点です。
ホールドタイム試験は「作った瞬間」ではなく「時間が経った状態」でエンドトキシンをきちんと拾えるかを問う試験です。スパイクしたエンドトキシンが保持中も回収できることを示せて初めて、その製剤のエンドトキシン試験は信頼できる、と言えます。
マスキングを解く（デマスキング）
LERが認められた場合、試験が正しく機能するようにデマスキングマスキング状態にあるエンドトキシンを前処理などによって再び検出可能な状態に戻す操作や手法の総称。（覆いを外す）の工夫をします。代表的には、二価金属イオン（マグネシウムなど）や分散剤・界面活性剤を試料前処理で加えて会合状態を戻す、加温するなど、いくつかの手法が検討されます。また、遺伝子組換えの第一因子（recombinant Factor C凝固カスケード最上流のFactor Cだけを組換えで再現した非動物由来試薬。グルカン干渉を受けにくい。：rFC凝固カスケード最上流のFactor Cだけを組換えで再現した非動物由来試薬。グルカン干渉を受けにくい。）を用いる方法など、検出系そのものを見直す選択肢も議論されています。いずれにせよ、「その製剤で本当にエンドトキシンを拾えるか」を実証したうえで試験法を確定することが要点です。
エンドトキシンを製造工程で下げる考え方はエンドトキシンの除去、迅速な微生物・エンドトキシン管理の位置づけは迅速微生物試験（RMM）もあわせて参照してください。
まとめ
- LER＝製剤にスパイクしたエンドトキシンが時間とともにLAL試験で検出できなくなる現象。汚染を見逃す方向の誤りになりうる。
- 引き金はキレート剤（クエン酸・リン酸）＋界面活性剤（ポリソルベート）。LPSの会合状態が変わり、Factor Cに結合しにくくなる。
- ホールドタイム試験でスパイク回収既知量を添加して回収できるかで分析法の妥当性を確認する試験。添加回収ともいう。を時間軸で確認し、必要ならデマスキングや検出系の見直しで試験の信頼性を担保する。
