NK細胞療法の製造工程とは？在庫型が成り立つ理由と凍結保存の課題

CAR-Tは患者ごとに製造するのに、NK細胞を在庫として持てるのはなぜか。理由は、NK細胞が持たないT細胞受容体（TCR）です。T細胞はTCRで相手の細胞の抗原を認識するため、他人のT細胞を投与すると、患者の組織を非自己と認識して攻撃し、移植片対宿主病（GvHD）投与した他家T細胞が患者の正常組織を攻撃する反応。他家細胞治療で重大なリスクになる。を起こします。NK細胞にはこの認識機構がないので、他家ドナーの細胞でも使えます。

在庫型あらかじめ製造・凍結して在庫し、需要に応じて出荷できる在庫型の供給運用。他家製品で成り立つ。が成り立つと、製造上の課題は「この患者に間に合うか」から「どの細胞を出発点にし、どう凍結し、どう輸送するか」へ移ります。

ただし、在庫型には凍結融解という別の関門が付きます。製造、購買、品質保証のどの立場でも、この移り方を押さえておくと、顧客や委託先の説明が読み取りやすくなります。

NK細胞は、TCRを持たないことでなぜ在庫型にできるのか？

TCRによる非自己の認識がないため、HLA細胞表面にあり自己と非自己を見分けるヒトの主要な組織適合抗原。他家では不一致が拒絶の原因になる。詳しく →を一致させない他家ドナーの細胞でも投与できるからです。

NK細胞は自然免疫のリンパ球で、表面マーカー細胞表面に出るタンパク質などの目印。MSCではCD73・CD90・CD105の発現などで細胞を見分けます。詳しく →は CD56 陽性、CD3 陰性。末梢血リンパ球の5〜15％を占めます。TCRの代わりに、活性化受容体と抑制性受容体のバランスで標的を選びます。CD16 は抗体のFc領域抗体の定常部にあたる「足」の部分。FcγRや補体、FcRnと相互作用し、機能や血中半減期を担う。詳しく →に結合する受容体なので、抗体医薬と組み合わせると、抗体が結合した腫瘍細胞に対する傷害活性が加わります。

この設計が臨床で検証された例が、2020年に報告された第1/2相試験です。臍帯血由来のNK細胞に、抗CD19のCAR、IL-15、安全スイッチの誘導型カスパーゼ9を導入し、再発または難治性のCD19陽性リンパ系腫瘍の患者11人に投与しました。HLAは一致させていません。8人で効果が得られ、7人は完全奏効。サイトカイン放出免疫が短時間で信号物質を大量に放出し、発熱・血圧低下・臓器障害へ進む激しい反応。詳しく →症候群、神経毒性、GvHD投与した他家T細胞が患者の正常組織を攻撃する反応。他家細胞治療で重大なリスクになる。は認められていません。著者らは、1ユニットの臍帯血分娩時に採取され凍結保存される造血幹細胞源。1単位あたりの細胞数が少ないという制約がある。詳しく →から100回分以上の細胞を製造できる可能性にも触れています。

100回分が取れるなら、製造の単位が変わります。自家のCAR-T患者や健常ドナーのT細胞にCAR（キメラ抗原受容体）を導入し、がん細胞を攻撃させる細胞治療。詳しく →なら患者100人に100回製造しますが、NK細胞では、1ユニットの臍帯血からの1回の製造を100人に分けて使う設計が描けます。自家CAR-Tでは、採取から投与まで商用製品でも1か月前後かかります（CAR-T細胞療法の製造工程）。在庫があれば、その待機期間を輸送の日数まで短縮できます。

代償もあります。1回の製造で多数の患者分を賄うため、そのロットの不適合は多数の患者に及びます（自家と他家の細胞治療）。この試験は11人の小規模な試験で、結果は方向性を示したにとどまります。

在庫型の根拠は、TCRT細胞が抗原を認識する受容体。他家CAR-Tではこれを壊してGvHDを防ぐ設計がある。詳しく →がなくGvHDが起きにくいことと、1回の製造で多くの投与分を確保できることの2つです。

何を優先するかで、出発点はどう変わるのか？

出発点は末梢血、臍帯血、iPS細胞体細胞を初期化して作る多能性幹細胞。同一株から繰り返し分化・製造でき均質性を高めやすい。詳しく →、細胞株のNK-92の4つで、優先するのが立ち上げの速さかロットの均一性かで決まります。

末梢血は、健常ドナーからアフェレーシス血液成分を分離して目的の細胞（単核球など）を採取する手法。細胞治療の出発材料の採取に使う。詳しく →で採取します。NK細胞はリンパ球の一部なので、磁気ビーズでCD3陽性細胞を除去し、CD56NK細胞の同一性確認に用いる表面マーカーで、CD3陰性と併せて評価する。陽性細胞を選択する分離を挟みます。Miltenyi Biotec の CliniMACS のようなGMP対応の磁気分離システムが使われます。

ドナー間の差は、拡大培養の数値にも出ます。2012年の報告では、22人のドナーのNK細胞を、膜結合型IL-21を発現させたK562細胞（フィーダー細胞NK細胞の増殖を助けるために一緒に加える支持細胞です。刺激因子を提示してNK細胞を増やす役目を持ち、あらかじめ放射線処理して自らは増えないようにします。詳しく →：増殖のシグナルを与える支持細胞）と21日間培養し、増殖倍率は平均で約4万8千倍、中央値で約3万2千倍。平均が中央値より高いのは、特に増殖の良いドナーが平均を押し上げているためと読めます。同じ条件で、膜結合型IL-15NK細胞の増殖と活性化を促すサイトカインで、IL-2とともに拡大培養の培地に加える。詳しく →を発現させたフィーダー細胞では、平均が825倍にとどまりました。

「フィーダーを使えば何万倍」という数値を見たら、サイトカイン細胞が放出する免疫の情報伝達物質。細胞治療では効果と安全性のリードアウトになる。詳しく →の種類と、何人のドナーの平均かを確かめます。フィーダー細胞は最終製品に残さない原材料なので、放射線照射で増殖能を止め、残存しないことを示す試験が付きます（NK拡大用フィーダー細胞、NK細胞用培地）。

臍帯血は、バンクに凍結保存生きた細胞を低温で止めて保管し、後で融解して使えるようにする技術。詳しく →された在庫を使えるので立ち上げが早い。一方で1ユニットの細胞数は多くないため、拡大培養に依存します。iPS細胞は、1つの細胞株から同じ性質の細胞を繰り返し製造でき、マスターセルバンクとして保持できるので、ロット間のばらつきを抑えたい在庫型に向きます。NK-92は、IL-2のみで増殖を続ける細胞株。簡便に増やせる代わりに、腫瘍由来なので投与前の照射が前提です。

選定を誤ると、後工程にまで響きます。末梢血のまま在庫を作ろうとすれば、ドナーが替わるたびに増殖倍率や機能が動き、ロット間の比較に手間がかかる。途中で出発点を変更すると細胞の性質が変わるため、安全性と力価の試験をやり直す前提で考えます。

CARを導入する場合は、成熟したNK細胞への遺伝子導入効率ウイルスベクターにより目的遺伝子が導入され、実際に発現・保有するようになった細胞の割合を示す指標。詳しく →が課題です。iPS細胞の段階でCAR特定の抗原を認識するよう設計し、細胞に導入して指向性を与える人工の受容体。詳しく →を導入する方法を含め、導入の選択肢はCAR-NK細胞の作り方、ベクターの調達はレンチウイルスの製造にあります。

出発点は細胞数で選ぶものではなく、ロットを揃えたいのか、早く立ち上げたいのかで選びます。

重要：T細胞向けの凍結手順で、なぜ融解後に4分の3が死滅したのか？

グランザイムNK細胞などが標的細胞に注入し、アポトーシス（細胞死）を誘導する酵素。Bが細胞内の顆粒から漏出し、NK細胞自身にアポトーシス細胞が遺伝的プログラムに従って自発的に死に至る過程で、壊死とは異なり膜の完全性が初期段階では保たれる。詳しく →を起こすからです。

在庫型は、凍結融解後にも機能が残って初めて成り立ちます。NK細胞は、ここが弱点です。

2024年に Nature Communications に報告された研究（Berjis ら）では、T細胞向けの凍結手順で凍結したNK細胞のおよそ4分の3が、融解後24時間以内に死滅しました。生存した細胞も、傷害活性が低下していた。原因は、標的細胞を傷害する酵素（グランザイムB）が顆粒から漏出し、自身にアポトーシス（細胞の自死）を誘導することでした。凍結前にIL-15とIL-18で前処理すると、融解後の回収率は約90〜100％まで上がり、マウスでの腫瘍の抑制も非凍結の細胞と同等だったと報告されています。

T細胞で通用した手順が、NK細胞にはそのまま使えない。CAR導入の難しさと同じ構図です。

融解後に手を打つ方法もあります。PM21粒子で拡大培養したNK細胞では、融解後に一晩静置すると回収率が平均73％になり、傷害活性は非凍結の細胞と差が認められなかったという2022年の報告があります。

静置には培養の設備と時間が必要で、凍結前の前処理とは、施設側に求める作業が変わります。

凍結保存液は、DMSOを含む既製品が主流です。BioLife Solutions の CryoStor のように、DMSO濃度が10％、5％、2％の3種類をそろえた製品があります。細胞毒性と凍結中の保護のバランスは細胞ごとに違うため、自社のNK細胞で検討して決めます。プログラムフリーザー冷却する速度を細かく制御して細胞をゆっくり凍らせ、凍結によるダメージを抑える装置です。詳しく →の凍結速度のプログラムも同じです（凍結保存液、プログラムフリーザー）。

T細胞向けの凍結手順を流用せず、融解後のどの時点の値で規格を置くかまで決めて、はじめて在庫型が製品として成り立ちます。

他家のNK細胞の輸送は、なぜ往復ではなく一方向になるのか？

患者ごとに採取しないため、製造拠点から各施設へ送るだけで完結するからです。

自家CAR-Tの輸送は、病院と製造施設の往復です。患者ごとに細胞を識別し、採取から投与までの日程を管理します。他家のNK細胞は、製造拠点から各施設へ一方向に輸送します。凍結した在庫を拠点か施設に置いておけば、患者が決まってから投与までの日数を、輸送の日数まで短縮できます。

その代わり、輸送と保管の逸脱は、1人ではなく、そのロットを受け取る全施設に及びます。凍結状態で輸送する容器の保持日数と温度記録、施設側の保管タンク、融解の手順書は、受け取る側が確認する対象です。容器の選び方とコールドチェーン製品を凍結・低温のまま保管・輸送する仕組み。細胞治療では生細胞率の維持に直結する。詳しく →の組み立ては、細胞治療の凍結保存とコールドチェーンと細胞治療の凍結保存と輸送にあります。

NK細胞に特有なのは、融解後に時間をかけにくいこと。融解後24時間のうちに、生存率細胞集団のうち生きている細胞の割合。凍結・培養の品質を示す基本指標。詳しく →も機能も大きく動きます。融解から投与までの許容時間は、凍結前の値ではなく、融解後に取得したデータで決めます。施設が融解から何分で投与できるかも、製品の設計に入ってきます。

他家のロットは、保存試料を残し、ロットから投与した患者までを追跡できるようにしておきます。1人の所見が出たときに、調査範囲を絞る材料になるからです。

出発点から凍結まで、何を確かめるか？

最初に確かめるのは出発点で、ここが決まると培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。詳しく →、フィーダー、凍結の資材と試験の範囲が決まります。

製造、購買、品質保証のどの立場でも使える確認項目です。

• 出発点⁠：何を使い、変更の予定はあるか。変更するなら、比較の試験が計画に入っているか
• ドナーとセルバンク目的物質を作る細胞をあらかじめ大量に凍結保存し、製造のたびに同じ素性の細胞を使えるようにした細胞の在庫（MCB/WCB）のことです。詳しく →⁠：末梢血や臍帯血なら、ドナー適格性の記録と、1ロットに使うドナーの数。iPS細胞やフィーダー細胞なら、セルバンクの来歴（ICH Q5D生物薬品の製造に使う細胞基材の樹立と特性解析について定めた国際調和ガイドライン。詳しく →）
• 増殖倍率⁠：ドナー数、培養日数、サイトカインの種類、平均か中央値かが付いているか
• 残存T細胞⁠：CD3陽性細胞の規格と、フローサイトメトリーでの測定法が決まっているか
• 力価⁠：傷害活性の試験が1種類だけでなく、複数の機能試験で力価を示す設計になっているか（細胞治療の力価試験）
• 出荷規格の時点⁠：融解直後か静置後か、どの時点の生存率と傷害活性で決まっているか
• 凍結の条件⁠：凍結保存液細胞を凍らせて保存する際、氷の結晶による傷みを抑えて生存率を保つための保護液です。詳しく →、DMSO濃度、凍結プログラムを、NK細胞で検討したデータがあるか
• 輸送と融解⁠：輸送容器の保持日数、温度記録、施設側の融解の手順書作業の手順を定めた文書。品質システムの要素を具体化し、査察でも運用が確認される。詳しく →が、受け取る前にそろっているか

資材と装置は、凍結バッグ、融解装置、液体窒素保存タンクの製品ページでも比較できます。

CARの導入と拡大培養の数値はCAR-NK細胞の作り方、自家と他家の違いは自家と他家の細胞治療、品質特性の全体像は細胞治療のCQA、傷害活性の測定法は細胞傷害性アッセイにあります。

参考文献

• Liu E et al., Use of CAR-Transduced Natural Killer Cells in CD19-Positive Lymphoid Tumors. New England Journal of Medicine. 2020;382(6):545-553.（臍帯血由来CD19 CAR-NKの第1/2相試験）
• Denman CJ et al., Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS ONE. 2012;7(1):e30264.（K562フィーダーでの21日間の拡大倍率）
• Berjis A et al., Pretreatment with IL-15 and IL-18 rescues natural killer cells from granzyme B-mediated apoptosis after cryopreservation. Nature Communications. 2024;15:3937.（融解後の死亡と前処理）
• Oyer JL, et al., Cryopreserved PM21-Particle-Expanded Natural Killer Cells Maintain Cytotoxicity and Effector Functions In Vitro and In Vivo. Frontiers in Immunology. 2022;13:861681.（PM21粒子で拡大したNK細胞の凍結融解後の回収と、ひと晩休ませた後の傷害活性。論文PDF）
• FDA, Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products（Draft Guidance, 2023年12月）
• ICH Q5D, Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products