抗体医薬基礎知識・培養

灌流培養のセルブリード制御とは？ VCDを一定に保つ考え方

Proglenth 編集部公開 2026-06-17約9分で読めます

灌流培養で最初に効いてくるのは、細胞が増えすぎることです。新鮮な培地を連続で送り、使った培地を細胞保持デバイス越しに抜く。栄養は枯れず、乳酸もアンモニアも溜まりにくい。細胞にとって好都合な環境がいつまでも続くので、増殖は止まりません。放っておけば生細胞密度は上振れし、酸素供給のほうが先に頭打ちになってしまいます。フェドバッチなら培養の後半で勝手に止まってくれた増殖が、灌流では止まらない。ここが最初の落差です。

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だから灌流の制御設計は、増やす工夫ではなく、増えた分をどう捨てるかの工夫です。培養液を細胞ごと系外へ引き抜く操作をセルブリードと呼びます。増える速さと抜く速さが釣り合ったところで密度は平らになる。この釣り合った状態が定常状態です。抜く量を決めているつもりで、実は増える速さのほうを決めている。そういう操作だと分かると、設計の手順が変わります。

本稿では、その釣り合いをどう作るかを整理します。抜く速さを決める式、密度を読む静電容量プローブ、供給側のCSPRとVVD、そしてブリード液に乗って出ていく製品。最後に、どれをどの順番で決めるかを並べます。数値は細胞株と培地と保持デバイスで動くので、絶対値ではなく範囲として読んでください。

この記事の要点

灌流培養ではセルブリードで増えた分の細胞を引き抜き、生細胞密度（VCD）を一定に保つことが制御の要です。
定常状態ではブリード率が正味の比増殖速度（μ−kd）に一致し、実効的な増殖速度を操る制御変数として働きます。
静電容量プローブで生バイオボリュームを連続測定してブリードを自動制御でき、最適点は培地・細胞株・保持デバイスに依存します。

増えすぎるから抜く ― 密度を平らに保つ理由

灌流のねらいは単純です。細胞を高い密度で長く飼い、槽1台あたりの生産量を稼ぐ。フェドバッチの生細胞密度が 10×10⁶〜20×10⁶ cells/mL あたりで頭打ちになるのに対し、灌流では 50×10⁶ cells/mL を超える密度を数十日にわたって維持する運転が報告されています。

ただし密度が日ごとに振れると、この利点は消えます。酸素の需要は細胞数にほぼ比例するので、密度が2割上がれば通気も増やさないと溶存酸素が落ちる。培地の供給量も同じです。密度が動くたびに供給側を追いかけるはめになり、そのたびに細胞の環境が揺れます。

密度を平らに保てば、比増殖速度も生存率も乳酸の蓄積も、日をまたいで大きくは動きません。入ってくる栄養と出ていく副産物の収支が釣り合っているからです。灌流の全体像は灌流培養とはにまとめています。ICH Q8(R2)が言う「変動要因を理解して設計空間の中で管理する」を灌流に当てはめると、出発点は密度を固定するところに置かれます。 平らな密度は、それ自体が品質のばらつきを抑える装置です。

抜く速さと増える速さの釣り合い

式は一行です。細胞は比増殖速度 μ で増え、比死滅速度 kd で減る。ブリードで培養液を抜く速さを希釈率 D_bleed、つまり1日あたり槽の何倍の体積を抜くかと書けば、密度が一定であるための条件は D_bleed ＝ μ − kd です。

CHO細胞の倍加時間が 20〜30時間なら、μ はおよそ 0.55〜0.83 day⁻¹ です。ただし高密度の定常状態では増殖が鈍り、μ は 0.2〜0.4 day⁻¹ 程度に落ち着くことが多い。kd が小さければ、D_bleed もこの範囲に入ります。槽の体積の2割から4割を、毎日捨てる計算です。

この式が言っているのは、ブリードが単なる廃棄ではないということです。抜く速さを変えれば、系全体の実効的な増殖速度が変わります。μ が高い局面ほど多く抜かなければ密度は上がる。逆に増殖が鈍ってきたのに同じ率で抜き続ければ、密度は静かに下がっていきます。 ブリード率は捨てる量ではなく、正味の増殖速度を決める操作量です。

POINT

定常状態では D_bleed ＝ μ − kd。抜く速さは正味の増殖速度に一致します。μ が高い局面ほど多く抜く。この当たり前の関係が制御の起点です。

静電容量プローブが読んでいるもの ― 誘電率と生バイオボリューム

密度を制御するには、まず密度が読めないと始まりません。ここで使われるのが静電容量プローブ、いわゆる誘電スペクトロスコピーです。

原理は膜にあります。無傷の細胞膜は絶縁体としてふるまい、交流電場の中で電荷を蓄えます。周波数を 0.1〜20 MHz のあたりで振ると、膜を持つ細胞の分だけ誘電率が持ち上がる。膜が壊れた死細胞では、この応答が出ません。つまりプローブが読んでいるのは細胞の個数ではなく、膜の無事な細胞が占める体積のほう、生バイオボリュームです。

装置としては、Aber Instruments の Biomass Sensors、Hamilton の Incyte Arc と Dencytee Arc、Sartorius の BioPAT Viamass あたりが使われます。信号は連続で出るので、そのままブリードポンプの指令に渡せます。読み値が狙いより高ければ Watson-Marlow や Masterflex のチューブポンプを回し、低ければ止める。サンプルを抜いて数えてから判断する運用より、応答はずっと速くなります。

系ごとの校正と参照計測

誘電率と生細胞密度の対応は、系が変われば変わります。細胞が大きければ、同じ個数でもバイオボリュームは大きい。培養後半に細胞が膨らめば、個数が同じでも信号は上がります。培地の導電率が変われば、電気的な背景そのものが動きます。

だから校正は系ごとに取ります。そして条件を変えたら取り直します。参照には Beckman Coulter の Vi-CELL BLU、ChemoMetec の NucleoCounter NC-202、Logos Biosystems の LUNA-FX7 といった自動セルカウンタを使い、1日1回から数日に1回の頻度で突き合わせるのが普通です。

ここを省くと、プローブは静かに嘘をつきます。信号が2割ずれたまま制御が回れば、密度も2割ずれたところで平らになる。トレンドグラフは美しく安定しているのに、狙いとは違う点で安定している。 校正のずれは、ばらつきではなく偏りとして出ます。

POINT

静電容量プローブは生きた細胞の膜が電荷を蓄える性質を使い、生バイオボリュームを連続で読みます。制御に使えば密度は狭い窓に収まりますが、校正がずれていれば、狭い窓ごと狙いから外れます。

供給側の二つの数字 ― CSPRとVVD

ブリードは抜く側の操作です。入れる側にも、対になる数字が二つあります。

一つは CSPR（cell-specific perfusion rate）。灌流速度を生細胞密度で割った値で、細胞1個を1日養うのに何 nL の培地を使うかを表します。報告される範囲はおおむね 20〜100 pL/cell/day で、50 pL/cell/day 前後を狙う設計がよく見られます。CSPRを下げれば培地は節約できますが、下げすぎれば栄養が足りません。

もう一つは VVD（vessel volumes per day）。槽の体積を1日に何回入れ替えるかで、1〜2 VVD あたりが一般的、高密度では 5 VVD 近くまで上がります。CSPRと目標密度を決めれば、VVDは自動的に決まります。裏を返せば、密度を上げるほど必要な培地量も増えるということです。灌流向けに濃く設計された培地、たとえば Gibco の High-Intensity Perfusion CHO Medium のような製品は、同じ栄養をより低いCSPRで届けるために作られています。

ブリードで密度を固定し、供給側でCSPRを狙いに合わせる。灌流の基本形はこの二本立てです。

ブリード液に乗って出ていく製品

抜いた培養液は捨てます。問題は、そこに何が入っているかです。

細胞保持デバイスが抗体を通す設計なら、ブリード液にも製品が含まれます。Repligen の XCell ATF や Spectrum Hollow Fiber Filters のような中空糸を使う構成では、分画分子量の選び方しだいで抗体は透過側へ回ります。この場合、ブリードで抜いた分の製品は回収されません。D_bleed が 0.3 day⁻¹ なら、単純に見積もって1日に槽内の製品の3割が系外へ出ていく勘定です。

だからブリードを増やすほど密度は下げやすく、同時に製品ロスも増えます。ブリード液を清澄化して製品を拾いにいく運用もありますが、工程が一つ増えます。保持デバイスの選択はこの損得に直結するので、ATFとTFFの差はATFとTFFの違いで確かめてください。

同じブリードでも、目的が変われば重心は動きます。播種密度を引き上げるN-1灌流では、短期間に高密度まで増やすことが目的で、長期の定常維持は狙いません。定常を保つための制御と、短期で駆け上がるための制御は別物です。 ブリードの設計値は、その培養が何日続く前提かで変わります。

決める順番

最後に、順番を並べます。

先に決まるのは目標のVCDです。酸素供給の上限と培地の供給能力から、その槽で養える天井が出ます。50×10⁶ cells/mL を狙うのか、そこからさらに押すのか。ここが決まらないと、CSPRもVVDも計算できません。

次にCSPRを置きます。50 pL/cell/day 前後から始め、代謝物の残り具合を見て上下させる。目標密度とCSPRが決まれば灌流速度が決まり、VVDが出ます。培地の消費量と廃液の量も、この時点で見えます。

そのうえでD_bleedを扱います。といっても自分で選ぶ数字ではなく、定常状態で μ − kd に落ち着く値です。決めるのは制御の作り方のほうで、プローブの信号でフィードバックを回すのか、一定率で抜いて多少の上振れを許すのか。 D_bleedは設定値ではなく、制御が探し当てる値です。

最後に校正と参照計測の頻度を決めます。ここまでの三つが正しくても、プローブがずれていれば全部ずれる。連続工程の管理戦略では定常であることが前提に置かれ、ICH Q13の枠組みもそこから始まります。定常かどうかを判定しているのは、結局このプローブです。 灌流で最後に効くのは、いちばん地味なこの突き合わせです。