抗体のTm（融解温度）とは？Tmが高くても凝集することがあるのはなぜか

抗体のTm（融解温度熱で抗体の立体構造がほどける転移の中点にあたる温度。高いほど保存中や製造中の熱ストレスで構造が崩れにくい。詳しく →）とは、熱をかけたときに抗体の折りたたみがほどける温度で、候補の抗体や処方を選ぶときの目安に使われます。Tmが高い分子ほど、熱や凍結融解凍結と融解の繰り返し。濃縮・局所pH変化・氷界面への吸着が重なり凝集の引き金になる。詳しく →でほどけてから固まる凝集を起こしにくい傾向があります。

一方で、Tmが高ければ凝集しないとは言えません。皮下注皮膚の下に注射する投与経路。一度に入れられる液量が小さく、抗体の高濃度化が求められる。詳しく →のような高濃度の製剤では、ほどけないまま分子どうしが寄り合う凝集が起こり、これはTmに表れないからです。

この記事では、Tmが何を表すか、Tmで凝集を予測しきれない理由、凝集の種類ごとに何で比べるか、Tmの一覧を受け取ったときに何から確かめるかを順に説明します。

1. 凝集のしやすさではなく、ほどけにくさ：抗体のTmは何を表す数字なのか？

Tmは、抗体1分子の折りたたみが半分ほどける温度で、その分子のほどけにくさを表します。

抗体は決まった形に折りたたまれて働きます。温度を上げていくと、その折りたたみは少しずつほどけ、分子の半分がほどけた温度がTm（融解温度）です。Tmが高い分子ほど、熱でほどけにくいと言えます。

このほどけにくさを、構造安定性タンパク質の折りたたみがどれだけほどけにくいかの安定性。変性を経る凝集のしにくさに効く。詳しく →と呼びます。凝集のしやすさを直接測った値ではなく、凝集の起こり方の1つに関わる性質を測った値です。

Tmは、温めながら試料が吸収する熱を測る示差走査熱量測定（DSC）試料を加熱しながら熱の出入りを測り、融解や転移などの熱事象を捉える分析法。で求めます。抗体自身が出す蛍光の変化を追うnanoDSF分子がほどけるのに伴う蛍光の変化を追って融解温度を求める手法。少量・多検体で回しやすい。詳しく →でも測れます。

数字が1つで並べやすいため、開発の初めに候補の抗体を順位づけしたり、pHや添加剤を変えた処方を比べたりするときによく使われます。抗体にはほどける部位ごとに複数のTmがあり、どの山の数字か、昇温の速さや緩衝液溶液のpHを一定範囲に保つために使用される弱酸と共役塩基の混合溶液。詳しく →でどれだけ動くかはDSCで熱安定性を見るとはで説明しています。冷蔵保存の期間までTmから読めるかは抗体の保存安定性はDSCで予測できるかにあります。

Tmが答えるのは「ほどけやすいか」で、「凝集するか」ではありません。では、なぜその2つがずれるのでしょうか。

2. 重要：なぜ、Tmが高くても凝集することがあるのか？

抗体の凝集には2つの経路があり、Tmが対応するのは、ほどけてから固まる経路だけだからです。

凝集の2つの経路

• ほどけて固まる経路⁠：熱、pH、容器や気泡の界面、凍結融解のストレスで構造が緩むと、内側に隠れていた水をはじく面が表に出ます。その面どうしがくっついて固まる経路で、ほどけにくさ、つまりTmが効きます。
• 寄り合う経路⁠：形を保ったまま、分子どうしが引き合って集まる経路です。分子の表面の電荷や、水をはじく面の並び方で決まり、1分子のほどけにくさは映りません。

2つ目の経路の起こしにくさを、コロイド安定性と呼びます。反発し合う分子は集まりにくく、引き合う分子は集まりやすい。

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高濃度で目立つ寄り合う凝集

寄り合う経路が目立つのは、皮下注のように抗体を濃くする製剤です。分子がぶつかる回数が増えるからです。Tmが最も高い候補を選んでも、濃縮した処方では高分子量体タンパク質分子どうしが結合してできた高分子量の集合体です。有効性や免疫原性に影響するため、その含量を測ります。詳しく →（HMW：凝集体）が保存中に少しずつ増えることがあります。

2つの経路が別々に動くことは、抗体以外のタンパク質でも示されています。Chiらは2003年、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）で、凝集の速さを決める要因が溶液の条件で入れ替わることを報告しました。

糖を足して構造を安定にすると凝集が減る条件がある一方で、pH 3.5の低イオン強度では、分子どうしの強い反発が凝集を抑えていました。ほどけかけた分子がいても、出会ってくっつかなければ凝集体にはなりません。

Tmの高さが示すのは、片方の経路の起こりにくさだけです。だからこそ、どちらの凝集を心配しているかを先に決める必要があります。

3. 経路で指標を選ぶ：凝集のしにくさは何で比べるのか？

見たい凝集が、ほどけて固まる凝集ならTmを、高濃度で寄り合う凝集ならkDやB22溶液中で分子間に働く引力・斥力の強さを示す指標。コロイド安定性の評価に使う。を指標にします。

場面ごとに合う指標

寄り合いの強さは、溶液に光を当てて散らばり方を見る光散乱で測ります。分子どうしの引き合いを表す値は、次の2つです。

• kD（拡散相互作用パラメータ）：動的光散乱（DLS）粒子による散乱光のゆらぎから粒径分布を求める測定法。集団平均を見るため大粒子に感度が偏る。詳しく →で、濃度を変えたときに分子が動く速さの変わり方から求めます。
• B22（第二ビリアル係数）：静的光散乱（SLS）で、濃度を変えたときの散乱光の強さの変わり方から求めます。

どちらも、おおむね正なら分子は反発し合い、負なら引き合っていることを示します。場面ごとに合う指標を並べると、次のとおりです。

Saitoらは2013年、モノクローナル抗体単一のクローンに由来し、同じ標的部位を認識する均一な抗体。詳しく →の処方を、イオン強度と糖を変えながら光散乱やDSCで調べました。糖による凍結融解での凝集の改善は構造安定性（ほどける温度）の向上と対応し、加速条件（40℃で保存して変化を早める試験）での凝集はB22と定量的に相関しました。

ただし、kDとB22はどちらも薄い溶液を何段階か作って求める値なので、最終濃度での会合や粘度液体の流れにくさを表す物理的性質で、タンパク質濃度の上昇に伴い非線形に増大する。詳しく →は、実際の高濃度の試料で測り直します。

開発可能性抗体を医薬品として無理なく製造・製剤できる見込みの高さ。凝集・安定性・粘度などを早期に評価する。詳しく →の評価でも、2つは別の項目として扱われます。Jainらは2017年、臨床段階の抗体137本を同じIgG1の型にそろえて12種類の試験で測り、Tmと自己会合を別々に評価しました（抗体の開発可能性評価）。

それでもTmを測る理由

Tmで凝集のすべてを予測できなくても、測る意味は残ります。

1. 足切りのため⁠：ほどけやすい分子は、熱にも凍結融解にも界面にも弱い傾向があるため、Tmの低い候補は、ほかの指標がよくても警戒して見ます。
2. 同じ抗体で処方を比べるため⁠：pHや添加剤を変えてTmが動けば、その処方が構造に効いたことが分かります。

ただし、Tmが上がったことを、凝集が減ったことと読み替えることはできません。Tmは候補を絞り込む段階の物差しです。高濃度で凝集しないことを裏づけるには、kDやB22とHMWの実測を組み合わせる必要があります。

4. 自分の候補では、何から確かめるのか

Tmの高さを比べる前に、どの凝集を心配しているかを決め、それに合う指標と条件で測ったかを確かめます。

候補を選ぶとき、受託先の成績書でTmの一覧を受け取ったときは、次の順に確かめます。

• 心配する凝集を決める⁠：熱、凍結融解、高濃度での寄り合い、振とうや界面のどれを見たいのかを先に決めます。
• Tm（融解温度）の条件をそろえる⁠：一覧の数字がどの山のTmか、同じ緩衝液、pH、濃度、昇温速度で測ったかを確かめます。
• 高濃度なら寄り合いも測る⁠：皮下注のような高濃度が想定なら、同じ候補処方で拡散相互作用パラメータ（kD）濃度に応じた拡散係数の変化から分子間の相互作用を表す指標。コロイド安定性の評価に使う。詳しく →か第二ビリアル係数（B22）溶液中で分子間に働く引力・斥力の強さを示す指標。コロイド安定性の評価に使う。も測ったかを聞きます。
• 処方を変えたら両方を見る⁠：塩や糖を足した処方で、Tmだけでなく拡散相互作用パラメータ（kD）も動いたかを見ます。
• 最終濃度で実測する⁠：最終濃度の試料で、高分子量体（HMW：凝集体）と粘度を、保存期間を通して追っているかを確かめます。

どれも、Tmの数字が自分の心配する凝集に当てはまるかを確かめるための項目です。

見落としやすいのは、処方で塩を足したときです。浸透圧溶液中の溶質濃度で決まる、水を引き込む圧。培養では上昇が細胞ストレスになる管理項目。詳しく →を合わせるために塩を足すと、分子表面の電荷が遮られて反発が弱まり、kDが負に転じることがあります。Tmはほとんど動かないのに、高濃度での寄り合いだけが悪くなる組み合わせも起こりえます。

高濃度の凝集が出たあとの処方の打ち手は抗体製剤の凝集を防ぐ設計は何で決まるかに、工程のどこで凝集が増えるかは抗体の凝集は工程のどこで増えるのかにまとめています。凝集体を測る手法の使い分けは凝集体の分析法とはで、DLS溶液中の粒子がブラウン運動で散乱させる光の揺らぎから、タンパク質や凝集体の粒径分布を測る手法です。凝集の有無を素早く確認できます。詳しく →の読み方はDLS（動的光散乱）とはで解説しています。

参考文献

• Saito S, Hasegawa J, Kobayashi N, Tomitsuka T, Uchiyama S, Fukui K. Effects of ionic strength and sugars on the aggregation propensity of monoclonal antibodies: influence of colloidal and conformational stabilities. Pharm Res. 2013;30(5):1263-1280. doi:10.1007/s11095-012-0965-4（B22は40℃の加速条件の凝集と、構造安定性は凍結融解による凝集と対応）
• Chi EY, Krishnan S, Kendrick BS, Chang BS, Carpenter JF, Randolph TW. Roles of conformational stability and colloidal stability in the aggregation of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor. Protein Science. 2003;12(5):903-13. doi:10.1110/ps.0235703
• Jain T, Sun T, Durand S, et al. Biophysical properties of the clinical-stage antibody landscape. PNAS. 2017;114(5):944-949.
• Mahler H-C, Friess W, Grauschopf U, Kiese S. Protein aggregation: pathways, induction factors and analysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2009. doi:10.1002/jps.21566