CHO細胞培養のpH制御：CO2散気と重炭酸で酸性・塩基側を動かす

犯人はたいてい CO2 です。同じ制御ロジック、同じ設定値なのに、大きなタンクでは吹き込んだ CO2 が抜けきらず、溜まっていきます。pH のトレンドだけ眺めていると何も起きていないように見える。その間にも細胞は確実に痛んでいきます。CHO細胞抗体など組換えタンパク質の生産に広く使われる、チャイニーズハムスター卵巣由来の培養細胞です。詳しく →は代謝で乳酸などの酸を出すので、放っておけば pH は下がり続けます。だから培養液には重炭酸を中心とした緩衝系を組み込み、そのうえで装置側からも pH を能動的に動かします。

本稿では、重炭酸緩衝系溶けたCO2が酸、重炭酸イオンが塩基として釣り合う緩衝系。哺乳類細胞培養で最も一般的なpH緩衝。がなぜ CO2 で動くのかから始めて、酸性側と塩基側の使い分け、小スケールでは起きない pCO2培養液に溶けた二酸化炭素の分圧。大スケールで溜まりやすく、高すぎると増殖・生産性・品質を落とす。詳しく → の蓄積、死帯の設計と乳酸・浸透圧溶液中の溶質濃度で決まる、水を引き込む圧。培養では上昇が細胞ストレスになる管理項目。詳しく →の連鎖、そして大規模での CO2 除去を整理します。最後に、決める順番を並べます。数値は細胞株と培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。詳しく →と槽で動くので、桁の感覚として読んでください。pH という単独の数字を追っているつもりで、実は四つの変数の連鎖を動かしている、というのがこの話の骨格です。

重炭酸緩衝系 ― なぜCO2でpHが動くのか

哺乳類細胞の培養で最も一般的な緩衝剤は重炭酸ナトリウム溶けたCO2が酸、重炭酸イオンが塩基として釣り合う緩衝系。哺乳類細胞培養で最も一般的なpH緩衝。（NaHCO₃）です。体内の緩衝系と同じ仕組みをそのまま使えるため、生理に近い環境を再現しやすい点が選ばれる理由とされています。

化学的には、溶けたCO2が弱い酸としてはたらき、重炭酸イオン（HCO₃⁻）がその共役塩基として釣り合います。CO2が増えれば酸性側に、重炭酸が増えれば塩基性側に振れる関係です。両者の比とpHはヘンダーソン・ハッセルバルヒの式緩衝液のpHを酸と共役塩基の比から求める式。重炭酸緩衝ではCO2と重炭酸の比とpHを結ぶ。で結ばれ、この緩衝系のpKa緩衝が最もよく効くpHの目安となる値。重炭酸緩衝系ではおおよそ6付近にあるとされる。詳しく →（緩衝が最もよく効くpHの目安）は概ね六・一から六・四あたりとされています。

ここで押さえておきたいのは、培養の狙いpH（多くの抗体プロセスでおよそ六・八から七・二の範囲）が、このpKaより高い側にあることです。緩衝の中心から外れた領域で運転することになるため、緩衝の効きは万能ではなく、装置側の能動制御と組み合わせて初めて安定する。⁠重炭酸緩衝は土台であって、それだけでpHを保てるわけではない⁠。この前提を外すと、スケールアップでの見積もりが狂います。

酸性側と塩基側 ― CO2散気と塩基添加の使い分け

実際のバイオリアクター細胞やウイルスの培養を制御された環境下で大規模に行うための培養槽で、商業規模の製造に用いられる。詳しく →では、pHは二方向の制御ループで保たれます。

向きは二つです。pHが設定より高ければ酸性側へ動かし、手段は CO2 ガスの散気。低ければ塩基側へ動かし、手段は重炭酸ナトリウムや炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムの添加です。

pHが高いときは、CO2を吹き込んで CO2 と重炭酸の平衡を酸性側へずらします。pH の測定には Hamilton や Mettler-Toledo、Broadley-James のプロセス用電極が使われ、シングルユース使い捨ての樹脂製バッグや容器を用いる製造方式です。洗浄・滅菌の手間を減らせる一方、ステンレス設備と比べて特徴が異なり、目的に応じて選び分けます。詳しく →槽なら PreSens のような光学式のセンサースポットも選べます。逆にpHが低いときは、塩基をポンプで少しずつ加える。もう一つの選択肢として、CO2の吹き込みを止めて別のガス（窒素や空気）でCO2を追い出し、pHを上げる方法もあります。

塩基添加には副作用があります。液体の塩基を足すと培養液の浸透圧が上がり、大規模タンクでは混合が追いつかず局所的に高pHの領域ができて、細胞にストレスをかけることがある。塩基添加は効くが、浸透圧上昇と局所高pHという代償を伴う。この代償を避けたい場面では、ガスの出し入れだけで pH を保つ制御、たとえば空気散気を増減して CO2 除去を調整する方式が検討されます。 塩基添加は効きますが、浸透圧の上昇と局所の高 pH という代償が付いてきます。

pCO2の蓄積 ― 小スケールでは起きない問題

小さなフラスコやスケールでは、CO2の蓄積はあまり問題になりません。液面からの表面通気で相当量のCO2が抜けていくためです。タンクが大きくなると、この前提が崩れます。

蓄積の主な理由は二つあるとされます。一つは、CO2が培養液によく溶けること。もう一つは、大きなタンクほど液面が深く、下から入れた気泡が上がる間にCO2で飽和してしまうことです。気泡が液中に滞在する時間は、気泡がCO2で飽和するのに要する数秒よりずっと長いため、気泡はほぼ飽和した状態で液面に達する。結果として、散気だけでは CO2 を十分に抜き切れません。 小スケールで CO2 が問題にならなかったのは、制御が良かったからではなく、勝手に抜けていたからです。

溶存CO2（pCO2）が高すぎると、CHO細胞の増殖が抑えられ、生産性が大きく落ちることが報告されています。ある報告では、pCO2 が概ね 150 mmHg を超えると増殖阻害と顕著な生産性低下がみられた、とされます。糖鎖タンパク質に付加される糖の鎖状構造で、抗体の有効性・免疫原性などに影響する重要な品質特性。詳しく →（抗体に付く糖の鎖）のパターンなど品質側にも影響が及ぶ場合がある。一方で、生産性が最も高くなる pCO2 の範囲を おおよそ 30〜76 mmHg あたりに置いた報告もあり、狙いは「低ければよい」ではなく適切な帯に収めることにあります。pCO2は低すぎず高すぎず、条件依存の適正帯に収めるのが要点です。

溶存 CO2 そのものの測定には、Nova Biomedical の BioProfile FLEX2 や Roche CustomBiotech の Cedex Bio のように、血液ガス分析の原理を持ち込んだ分析計が使われます。pH と一緒に pCO2 を読めることが、この領域では効きます。

pCO2の蓄積は乳酸の代謝挙動とも絡みます。溶存 CO2 が高いと乳酸の消費への切り替わりが乱れやすいことが指摘されていて、この関係はCHO細胞の乳酸代謝シフトの側でも扱っています。 pCO2 は低ければよいのではなく、条件依存の適正帯に収める対象です。

pHの死帯（デッドバンド）と乳酸・浸透圧の相互作用

pHを一点に固定しようとすると、酸添加と塩基添加が交互に働いて制御が落ち着かず、試薬を無駄に消費しがちです。実務では設定値の上下に許容幅を設ける「死帯（デッドバンド制御で介入しない許容の幅。pH制御ではこの範囲内は薬剤を加えず、外れたときだけ調整します。）」を使い、その範囲内なら能動制御を動かさない設計にします。たとえば pH 7.0 に対して上下 0.03 といった幅がその一例です。典型的な設定値は 6.9〜7.2 の範囲に置かれます。

ただしこの幅の設計は、乳酸と浸透圧の相互作用と切り離せません。CHO細胞では、pHが下がるほど乳酸の生成が進みやすく、乳酸がさらにpHを下げるという悪循環に入ることがあります。これを断ち切るには塩基を足してpHを支える必要がありますが、塩基を足すほど浸透圧が上がり、乳酸が過剰に溜まれば増殖が鈍る。

連鎖は三段で回ります。pHが下がれば乳酸の生成が進み、さらにpHが下がる。塩基を足して支えれば、浸透圧とpCO2が上がる。乳酸が過剰に溜まれば、pH低下と浸透圧上昇が重なって増殖が鈍る。

死帯を狭くすればpHは安定しますが、そのぶん塩基やCO2の投入が増え、浸透圧やpCO2の管理が難しくなります。逆に広げれば試薬は減るものの、pHの振れが品質に響くおそれがある。死帯の設計は、pHの安定と浸透圧・乳酸・pCO2の抑制とのバランスをとる作業です。この判断は本培養の運転設計そのものと一体で考える必要があります。

大規模でのpCO2ストリッピング

スケールアップで最後に効いてくるのが、溜まったCO2をいかに抜くか（ストリッピング通気でガスを追い出す操作。培養では溜まったCO₂を気泡で排出することを指す。）です。小スケールで最適だった散気・撹拌の条件が大きなタンクでそのまま通用するとは限らず、ここで想定外の問題が出やすい。

CO2除去の効率を決めるのは、気液の接触と液面から抜ける経路です。表面通気を強めれば除去は進みます。ただしその効き目は、スケールが大きくなるほど鈍ると指摘されています。タンクが大きくなると液の体積に対する表面積の比が幾何学的に小さくなるためで、大きなタンクほど、表面から抜く経路は当てにできません。液の体積に対する表面積の比は、スケールが上がるほど幾何学的に不利です。

そこで効いてくるのが散気側の設計です。ただし高密度の流加培養では、CO2を抜くために散気を強めると、スパージャー（散気口）から入るガスの流速が上がり、気泡による物理的なストレスが細胞にかかることがあります。ある事例では、2,000 L の使い捨てバイオリアクター使い捨ての樹脂製バッグを培養容器に用い、洗浄・滅菌の手間を省いて交叉汚染のリスクを下げる培養装置です。詳しく →へのスケールアップで、このガス流速の上昇と溜まった pCO2 が力価低下の原因として挙げられました。CO2を抜こうとする操作と細胞を傷めない操作は、しばしば引っ張り合う。⁠大規模のpCO2管理は、CO2除去と気泡ストレス低減のせめぎ合いを解く設計です。

こうしたトレードオフは机上だけでは詰め切れません。CO2の物質移動を表すモデルを使って散気戦略を設計し、実機で検証する進め方が現実的とされています。槽の側は Sartorius の Biostat STR、Thermo Fisher Scientific の HyPerforma、Cytiva の Xcellerex XDR といった構成で、スパージャー培養槽の底などからガスを気泡として吹き込み、酸素供給やCO₂排出を行う散気装置。詳しく →の形も機種ごとに違います。pH 制御を単独の操作としてではなく、散気と撹拌と供給を含む運転設計として組み立てる。その視点が、大規模での見通しを広げます。 大規模の pCO2 管理は、CO2 除去と気泡ストレス低減のせめぎ合いを解く設計です。

決める順番

最後に、順番を並べます。

先に置くのは pCO2 の目標帯です。低ければよいのではなく、報告されている適正帯はおおむね 30〜76 mmHg で、150 mmHg を超えると増殖も生産性も落ちます。自社の系でどこに置くかを先に決めます。 pCO2 の目標が決まらないうちは、散気の設計に根拠が立ちません。

次に、pH の設定値と死帯の幅を決めます。6.9〜7.2 のどこに置き、上下にどれだけの幅を取るか。狭くすれば安定しますが塩基とCO2の投入が増え、広げれば試薬は減るが振れが品質に響きます。

そのうえで、酸性側と塩基側のどちらをガスで、どちらを液で動かすかを決めます。塩基を液で足すほど浸透圧が上がるので、ガスの出し入れで賄える範囲をできるだけ広く取ります。

最後に散気の設計に戻ります。CO2 を抜くために流速を上げれば、気泡による物理的なストレスが増える。2,000 L 級では、この引っ張り合いが力価に出た事例が報告されています。 CO2 を抜く操作と細胞を傷めない操作は逆を向くので、どちらを優先するかを先に決めておきます。

参考文献

• ICH Q11原薬の開発・製造を扱い、原薬側の管理戦略の作り込みを示すICHのガイドライン。詳しく →, Development and Manufacture of Drug Substances（原薬の開発と製造に関する指針の入口）
• ICH Q8医薬品開発とQbDの考え方を示すICHガイドライン。重要品質特性（CQA）を定義している。詳しく →(R2), Pharmaceutical Development（医薬品開発・QbDに関する指針の入口）
• FDA, Vaccines, Blood & Biologics（バイオ医薬品の製造・品質に関する情報の入口）
• EMA, Scientific guidelines（品質・製造に関する科学ガイドラインの入口）
• USP米国で医薬品・原料・試験法の公式基準を定める公定書で、製薬用水に関する規格も収載されている。詳しく →, USP–NF General Chapters（一般試験法の入口）