抗体の保存安定性はDSCで予測できるか

Schönらが2024年にAnalytical Biochemistry誌に発表した論文は、この距離を詰められるかを正面から論じています。抗体のように熱変性が不可逆で、しかも速度論に支配される場合、DSCは変性温度(Tm)だけでなく、Tmでの変性の速さと、その活性化T細胞を抗原刺激や人工的な刺激試薬で活性化し、増殖・機能発揮できる状態に誘導する操作。詳しく →エネルギーまでを与えます。この3つを使えば、低温での変性の速さを計算で外挿できるのではないか、という問いです。

本稿では、DSCが不可逆な変性から何を取り出すのかをたどり、なぜ素朴な外挿が破綻するのかを見ます。そのうえで、保存期間の見積もりがどこまで言えてどこから言えないのかを、実在の装置に沿って5分で確かめます。

この論文が言っていること

論文の主張は、保存安定性はDSCから見積もれる余地があるが、Tmの高さだけでは言えない、という一点にあります。

抗体の熱変性は多くの場合もとに戻りません。ほどけた分子がそのまま絡み合うので、測り方しだいで見かけの温度が動きます。この不可逆な転移を速度論として解くと、DSCからは3つの量が出ます。見かけの変性温度(Tm)、そのTmでの変性の速さ、そして温度を上げたときに速さがどれだけ跳ね上がるかを表す活性化エネルギーです。Schönらは、この3つが低温への外挿に欠かせないと示したうえで、しかしそれだけでは25℃以下への正確な外挿には足りないと釘を刺しました。理由は、抗体の変性や凝集の速さが、温度に対して直線のアレニウス則に乗らないからです。グラフは曲がります。この曲がりを無視して、速さを測りやすい50〜60℃のデータだけを直線で低温へ引き延ばすと、速さが実際よりはるかに遅く見積もられます。論文はその行き着く先を具体的に書いていて、そうやって出した保存期間は地球の年齢(約46億年)を超える、つまり誰も信じない数字になると指摘しました。正しく外挿するには、曲がりを織り込んだ速度論解析で低温の変性速度を求めるしかありません。

Tmを高い順に並べるだけでは、その処方が冷蔵庫で何年もつかは言えません。速さと活性化エネルギーまで含めて、はじめて何年という時間を語れます。

DSCの外挿を実在の装置で追う

変性の速さと活性化エネルギーは、1枚のDSC曲線からは出ません。走査速度を変えてTmがどう動くかを見て、はじめて取り出せます。

ここで効くのが装置の測り方です。Malvern PanalyticalのMicroCal PEAQ-DSCは、130 µLのキャピラリーセルで2〜130℃をカバーし、走査速度を最速240℃/h(毎分4℃)まで変えられます。不可逆な転移では、速く昇温するほど見かけのTmが高温側へずれます。このずれ幅こそが活性化エネルギーの情報源で、論文の外挿はこの速度依存性を材料にします。TA InstrumentsのNano DSCも、キャピラリーセルで希薄な溶液の熱変性を高感度にとらえる構成です。一方、NanoTemperのPrometheusに代表されるnanoDSF(示差走査蛍光測定分子がほどけるのに伴う蛍光の変化を追って融解温度を求める手法。少量・多検体で回しやすい。詳しく →)は、トリプトファンの蛍光から見かけの融解温度熱で抗体の立体構造がほどける転移の中点にあたる温度。高いほど保存中や製造中の熱ストレスで構造が崩れにくい。詳しく →を少量かつ短時間で返しますが、変性に伴う熱そのもの、つまりエンタルピーは測りません。順位づけには向いても、論文が求める速度論解析の材料としては、熱量を直に測るDSCの曲線が要ります。

外挿の材料は、1枚のきれいなDSC曲線ではなく、走査速度を変えて得た曲線の集まりから出ます。

この論文だけでは決まらないこと

この論文が保証するのは、熱変性だけで分解が決まる場合の外挿の筋道です。実際の処方で何が先に壊れるかは、この論文の外からやってきます。

論文自身が条件を明記しています。速度定数の外挿から保存期間を見積もれるのは、熱変性が唯一の分解反応であるときに限られます。現実の抗体製剤では、脱アミド化アスパラギンなどが変化して電荷が変わる化学的分解。特定の隣接配列で起きやすい。詳しく →や酸化のような化学分解も進みますし、折りたたみがほどけないまま分子どうしが寄り合う天然状態の凝集もあります。後者がTmに表れないことは、Tmが高い抗体なら凝集しにくいかが構造安定性とコロイド安定性抗体が水溶液中で会合せず、安定に散らばっていられる性質。凝集のしにくさに関わる。詳しく →という2つの軸から整理しています。そもそもDSCのTmが転移ごとに分かれ、走査速度で数字が動く事情は、DSCでタンパク質の熱安定性(Tm)を測るが実機の仕様に沿って詳しく扱っています。熱変性以外の経路が律速になれば、どれだけ丁寧に変性速度を外挿しても、現実の保存期間とはずれます。

論文が示すのは、熱変性だけで決まる場合の見積もり方です。実際の保存で何が速度を決めるかは、ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。詳しく →に沿った実時間・加速の安定性試験でしか確かめられません。

参考文献

• Schön, A., Kwon, Y.D., Bender, M.F., Freire, E. "Extrapolating differential scanning calorimetry data for monoclonal antibodies to low temperatures." Analytical Biochemistry 691, 115533 (2024). DOI: 10.1016/j.ab.2024.115533
• ICH Q5Cバイオテクノロジー応用医薬品の安定性試験の考え方を示す国際調和ガイドライン。詳しく →. Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products. International Council for Harmonisation.