二重特異性抗体の精製は、2段階まで減らせるのか

二重特異性抗体2つの異なる標的に同時に結合する抗体。T細胞と標的細胞を橋渡しする用途などがある。詳しく →は、2つの異なる標的に結合する腕を1つの分子に持たせた抗体です。作るときに狙いと違う組み合わせの分子ができやすく、それが精製の段数と収率に響きます。

ただし、副産物を精製だけで追いかける必要はありません。LinとLee（2026）は、作る段階の工夫で副産物を先に減らし、2段階のアフィニティ特定の相互作用を使って目的物を選択的に捕まえる精製法。ヘパリンやタグへの親和性などを利用する。詳しく →精製で純度の高い二重特異性抗体を得る手順を報告しました。

副産物が精製で落ちにくい理由から始めて、論文の手順、副産物が減る理由、代わりに増える工程、自社の分子に当てはめる前に確かめることをたどります。

1. 重要：二重特異性抗体の副産物は、なぜ精製で落ちにくいのか

副産物も目的の分子と同じ抗体の形をしていて、大きさも電荷も近いからです。 2種類の重鎖抗体を構成する2種類のポリペプチド鎖のうち分子量が大きい方で、抗体の基本骨格と主要な機能領域を担う。詳しく →と2種類の軽鎖抗体を構成する2種類のポリペプチド鎖のうち分子量が小さい方で、重鎖と対になって抗原結合部位を形成する。詳しく →を同じ細胞で作らせると、同じ重鎖どうしが組んだ分子や、軽鎖が違う相手と組んだ分子ができます。

どれも抗体の土台の部分（Fc）を持っています。そのため、精製の1段目に使う Protein A抗体に特異的に結合するProtein Aを担体に固定し、抗体だけを選択的に捕まえて精製する手法です。抗体医薬の最初の精製工程として定番になっています。詳しく → のレジンクロマトグラフィーで目的物や不純物を結合させる粒子状の充填材。精製モードごとに使い分ける。詳しく →には、目的の分子と一緒に捕まります。仕上げの精製で似た分子を追いかけるほど段数が増え、そのたびに収率が削られていきます。

副産物を精製で分けるのが難しいなら、作る段階で減らせないかという問いが残ります（二重特異性抗体の製造課題）。

2. 論文は、副産物を減らすためにどんな手順を組んだのか

別々に作った2種類の抗体を穏やかな還元で半分に分け、混ぜて組み直し、2段階のアフィニティ精製で仕上げる手順です。 二重特異性抗体の実験手順を集めた書籍（Methods in Molecular Biology、第2997巻）の1章として示されています。

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手順は3段です。

1. 2種類の抗体を別々に作る⁠：2本の重鎖が向き合う面に、片方は突起、もう片方はくぼみを作る変異を入れます。この変異がノブ・イントゥ・ホール一方の重鎖に突起、他方にくぼみを作り、鍵と鍵穴のように噛み合わせて正しい対を促す設計。詳しく →（KiH）です。
2. 穏やかに還元する⁠：2本の重鎖をつなぐ結合だけを切ります。重鎖と軽鎖のつながりと、抗原をつかむ腕の形は保たれたまま、抗体が重鎖1本と軽鎖1本の半分子に分かれます。
3. 混ぜて再び酸化する⁠：2種類の半分子が組み直され、腕を1本ずつ持ち寄った分子ができます。この操作が制御下Fab-arm交換（cFAE）です。

仕上げは、2段階のアフィニティ精製です。残った副産物をここで取り除きます。

3. なぜ、この手順だと鎖の組み合わせ違いが減るのか

軽鎖は最初から正しい重鎖と組んだまま半分子になり、重鎖どうしは突起とくぼみが合う組み合わせのほうが安定して組み直されるからです。 2つの工夫が、別々の副産物に効きます。

• 軽鎖の取り違えを避ける⁠：2種類の軽鎖を同じ細胞の中で混ぜないので、別の重鎖と組む機会がありません。
• 同じ重鎖どうしの組み合わせを減らす⁠：突起は突起と重なれず、くぼみどうしでは隙間が埋まりません。だから、突起とくぼみの組み合わせが優先されます。

とはいえ、組み合わせ違いがゼロになるわけではありません。還元の条件が強すぎれば、重鎖と軽鎖のつながりまで切れ、再酸化のあとに取り違えた分子が出ます。精製の2段階は、その残った分を取り除くために置かれています。

4. 「精製は2段階で足りる」は、どこまで言えるのか

言えるのは、この手順なら高い純度の分子を2段階のアフィニティ精製で得られたというところまでです。どの抗体の組み合わせでも2段階で済むとまでは言えません。 この章が示すのは実験の手順で、工業規模で作った報告ではないからです。

1段目は、抗体の土台をつかまえる Protein A の精製が定番です（Protein A クロマトグラフィー）。分かれ目は2段目。親の抗体どうしの何が違うかによって、使う手段が変わります。

反応の工程を足した分、精製の前に確かめることも増えます。還元剤を使うので、その品質の基準を決め、反応のあとに還元剤を除くバッファ交換を工程に入れます。

cFAE を単独で大きな規模まで広げた報告はあります。GMP医薬品を一定の品質で安全に造るために守るべき製造・品質管理の基準（適正製造規範）です。詳しく → の規模で、反応を約60 L まで広げて交換率90%超、純度95%超を得たとする2023年の報告。親の抗体を1,000 L で作り、キログラム規模で交換率95%超を得たとする2013年の報告もあります。ただし、どちらも KiH と併用した今回の手順の実績ではありません。

参考文献

• Lin, L.Y.C., Lee, K.H. "Production of Bispecific Antibody Combining Knobs-into-Holes and Controlled Fab-Arm Exchange Methods." In: Yasunaga, M. (ed.) Bispecific Antibodies: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology, vol. 2997. Humana, New York, NY (2026). DOI: 10.1007/978-1-0716-5037-0_1（穏やかな還元で半分子にし、KiH の変異で組み直して、2段階のアフィニティ精製で精製する手順）
• Labrijn, A.F., et al. "Efficient generation of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange." Proceedings of the National Academy of Sciences 110(13), 5145-5150 (2013).
• Yao, et al. Large scale controlled Fab exchange GMP process to prepare bispecific antibodies. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2023;11.（約60 L の反応、交換率90%超、純度95%超）
• Gramer, M.J., et al. Production of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange: Scalability from bench to large-scale manufacturing by application of standard approaches. mAbs. 2013;5(6):962-973.（親抗体1,000 L、キログラム規模で交換率95%超）