二重特異性抗体の製造課題とは？

この「2種類を1分子に載せる」という発想は、そのまま製造の難しさに直結します。抗体は重鎖2本と軽鎖2本が正しく組み合わさって初めて機能しますが、由来の異なる鎖を混ぜると、意図しない組み合わせ（ミスペアリング由来の異なる重鎖・軽鎖が意図しない組み合わせで結合してしまう副産物発生の現象。）が大量に生まれます。目的の分子と、構造のよく似た副産物とを、どう作り分け、どう分離するか。ここが実務の中心になります。

結局のところ、二重特異性二種類の異なる標的に同時に結合できるよう設計した抗体。抗体づくりの成否は、鎖をどう組み合わせるかというひとつの問いに集約されます。設計段階でミスペアリングをどれだけ抑え込めるか、そして残った副産物を精製と品質管理遺伝子治療製品の品質・安全性・有効性を保証するために製造・出荷の各段階で実施する試験・管理の総体。でどこまで見分けられるか。よく似た分子の中から目的の一種だけを確実に取り出せるかどうか、その一点に多くがかかっています。

なぜ組み合わせ問題が起きるのか

一般的なIgG抗体は、2本の重鎖抗体を構成する2種類のポリペプチド鎖のうち分子量が大きい方で、抗体の基本骨格と主要な機能領域を担う。と2本の軽鎖抗体を構成する2種類のポリペプチド鎖のうち分子量が小さい方で、重鎖と対になって抗原結合部位を形成する。からなり、左右対称です。片方の抗体（抗体A）だけを作る分には、細胞の中で同じ鎖どうしが自然に組み合わさるので大きな問題は起きません。

二重特異性分析法において、共存する不純物・分解物・添加剤などが存在しても目的成分だけを正確に測定できる能力。抗体では、抗体Aと抗体Bという由来の異なる成分を1つの細胞に発現目的タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で転写・翻訳させ、機能的なタンパク質として産生させる工程。させます。すると鎖の組み合わせが一気に増えます。

• 重鎖の組み合わせ⁠：AとAが対になったもの（ホモダイマー）、BとBが対になったもの、そして狙いであるAとBが対になったもの（ヘテロダイマー異なる2本の重鎖が対になった分子。二重特異性抗体で狙う正しい組み合わせ。）。放っておくとおおむね1:1:2に近い割合で混ざります。
• 軽鎖の取り違え⁠：軽鎖Aが重鎖Bに、軽鎖Bが重鎖Aに間違って乗ってしまう組み合わせ。

つまり何もしなければ、目的のヘテロダイマーは全体の一部にしかならず、残りは構造の似た副産物です。しかも副産物は目的分子とサイズや電荷が近く、後工程での分離が難しくなります。⁠設計で作り分けを促し、精製で仕上げるという二段構えが、二重特異性抗体づくりの基本方針になります。

設計で「正しい対」を促す

副産物を後から取り除くより、そもそも正しい組み合わせができやすい設計にしておくほうが効率的です。代表的な工夫が2種類あります。

重鎖どうしを正しく組ませる

重鎖AとBのヘテロダイマーを優先させる代表例が、いわゆるノブ・イントゥ・ホール一方の重鎖に突起、他方にくぼみを作り、鍵と鍵穴のように噛み合わせて正しい対を促す設計。（KiH一方の重鎖に突起、他方にくぼみを作り、鍵と鍵穴のように噛み合わせて正しい対を促す設計。＝一方の重鎖に突起、もう一方にくぼみを作り、鍵と鍵穴のように噛み合わせる設計）です。突起どうし・くぼみどうしは組みにくく、突起とくぼみの組（＝目的のヘテロダイマー）が優先されます。

同じ狙いで、界面の電荷を反発・引力になるよう置き換える静電ステアリング重鎖界面の電荷を反発・引力になるよう置き換え、目的のヘテロダイマー化を促す設計。もあります。いずれも「AとAは組みにくく、AとBは組みやすい」状態を界面設計でつくる考え方です。

軽鎖の取り違えを防ぐ

重鎖のヘテロダイマー化が解決しても、軽鎖が正しい重鎖に乗る保証は別にありません。ここへの対処にはいくつかの方向性があります。

• 2本の重鎖に対して共通して使える共通軽鎖2本の重鎖に共通して使える軽鎖を採用し、軽鎖の取り違えを防ぐ二重特異性抗体の設計。を採用し、取り違えの余地をなくす。
• 一方の腕のドメイン配置を入れ替える（ドメインクロスオーバー一方の腕のドメイン配置を入れ替え、正しい重鎖と軽鎖の対だけが噛み合う構造にする手法。）など、正しい対だけが噛み合う構造にする。
• そもそも軽鎖を持たないフォーマット（重鎖の一部だけを使う小型の形式など）を選ぶ。

抗体の製造骨格には共通点も多く、まず抗体医薬の製造工程で全体像を押さえると、二重特異性で「どこが上乗せの課題か」が見えやすくなります。

副産物をどう分けるか（精製の勘所）

設計で作り分けを促しても、副産物はゼロにはなりません。残ったホモダイマー同じ重鎖どうしが対になった分子。二重特異性抗体では目的でない副産物にあたる。や軽鎖ミスペア多重特異性抗体の製造時に、意図しない重鎖・軽鎖の組み合わせが形成されてしまう現象で、不純物となる副産物を生じさせる。体、さらに凝集体タンパク質分子どうしが結合してできた高分子量の集合体です。有効性や免疫原性に影響するため、その含量を測ります。詳しく →を分離するのが精製工程です。二重特異性抗体では、通常のモノクローナル抗体より一段難しくなります。理由は主に2つです。

• 副産物が目的分子とよく似ている⁠：ホモダイマーやミスペア体は、サイズも電荷も目的分子に近く、1回のクロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。では分けきれないことが多い。
• フォーマットによって捕捉工程培養液から目的の抗体だけを大きく濃縮・精製する工程。抗体医薬ではプロテインAが担う。の前提が変わる⁠：モノクローナル抗体の定番であるProtein A捕捉黄色ブドウ球菌由来のProtein Aをリガンドとして用い、抗体医薬の製造で抗体を選択的に捕捉・精製するアフィニティークロマトグラフィー法。は二重特異性でも使えることが多い一方、片方の腕がProtein A抗体に特異的に結合するProtein Aを担体に固定し、抗体だけを選択的に捕まえて精製する手法です。抗体医薬の最初の精製工程として定番になっています。詳しく →に結合しない設計だと結合の強さに差が出て、これを分離に利用できることもあれば、捕捉条件の再設計が要ることもあります。

実務では、捕捉のあとに電荷や疎水性分子が水と親和せず、油脂や非極性溶媒と相互作用しやすい性質で、二本鎖RNAと一本鎖RNAではその程度が異なり分離の指標となる。の違いを使った磨き上げ⁠（ポリッシング捕捉工程の後、電荷や疎水性の違いを使って残った副産物を削り純度を上げる磨き上げ精製。）を重ねて副産物を削っていきます。どの担体（レジンクロマトグラフィーで目的物や不純物を結合させる粒子状の充填材。精製モードごとに使い分ける。）をどう組み合わせるかは分子ごとに変わるため、精製レジンの選び方の考え方が土台になります。副産物の種類が多い分、モノクローナル抗体より工程段数が増えたり、収率と純度製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →のトレードオフがシビアになったりしやすい点は、コスト設計でも意識どころです。

品質管理で何を見るか

二重特異性抗体は、確認すべき「不純物・変化体」の顔ぶれがモノクローナル抗体より広くなります。品質管理では、目的分子を正しく定量することと、似た副産物を見分けることの両方が求められます。

目的分子と副産物の作り分けの証明

まず、⁠ヘテロダイマーの割合⁠（正しい対がどれだけできているか）そのものが重要な品質指標になります。ホモダイマーや軽鎖ミスペア体の残存を、質量分析分子の質量を精密に測る手法。鎖の組み合わせ違いを分子量差として捉え純度評価に使う。や電荷・サイズに基づく手法で確認します。とくに質量分析は、鎖の組み合わせ違いを分子量の差として捉えられるため、二重特異性の同定・純度評価で存在感が大きい手法です。

従来からの品質特性

これに加えて、一般的な抗体医薬の品質項目も引き続き対象です。

• 凝集体・会合体⁠：安定性や免疫原性薬そのものが患者の免疫応答を誘発しやすい性質。凝集体や不純物、投与経路、患者背景などが要因になる。に関わる重要項目。分離検出の考え方は凝集体分析の手法を参照。
• 電荷不均一性脱アミド化やC末端リジンなどで抗体分子の電荷が不均一になる現象。品質特性として管理される。⁠（チャージバリアント抗体などで電荷が異なる分子種のことです。脱アミド化などの修飾で生じ、酸性側・塩基性側の割合を分離して測る品質指標です。詳しく →）：脱アミド化やC末端リジンなどに由来する変化体。チャージバリアントで扱う視点がそのまま効きます。
• 糖鎖・宿主細胞由来不純物（HCP）・残存DNAなど⁠：抗体医薬に共通する管理項目。

なお、標的の異なる2つの機能を1分子に持つため、⁠効力評価も片側だけでなく両方の結合・機能を確認する設計が必要になります。分析法の妥当性確認（バリデーション）は、こうした複数の測定に対して行うことになります。

まとめ：作り分けと分離の二段構え

二重特異性抗体の製造課題は、突き詰めると「由来の異なる鎖を1分子に正しく組ませ、似た副産物と分ける」ことに集約されます。

• 設計⁠：KiHや静電ステアリングで重鎖のヘテロダイマー化を促し、共通軽鎖やドメインクロスオーバーで軽鎖の取り違えを防ぐ。
• 精製⁠：残った副産物を、捕捉＋ポリッシングで段階的に削る。副産物が目的分子と似ている分、工程は重くなりやすい。
• 品質管理⁠：正しい組み合わせの割合を質量分析などで示しつつ、凝集体・電荷変化体・HCPなど従来項目も併走で管理する。

フォーマットの選択が、効き方だけでなく製造性・精製性・安定性まで左右します。設計の段階から製造・分析を見据えておくことが、開発全体の効率に効いてきます。関連して、抗体を土台に薬物を結合させる抗体薬物複合体のDAR設計も、抗体をどう作り込むかという点で共通の発想を持ちます。

参考文献

• ICH Q6B, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
• ICH Q5E, Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in Their Manufacturing Process
• ICH Q2(R2), Validation of Analytical Procedures
• FDA, Bispecific Antibody Development Programs — Guidance for Industry
• USP <129>, Analytical Procedures for Recombinant Therapeutic Monoclonal Antibodies
• Ph.Eur, Monoclonal antibodies for human use — general monograph