LNPの封入率(EE%)測定とは？ RiboGreenアッセイで測る

その測定によく使われるのが、核酸に結合して蛍光を出すRiboGreenという色素を用いたアッセイです。考え方は差分法。界面活性剤タンパク質の凝集や容器壁への吸着を防ぐため製剤へ少量加える添加剤で、細胞培養で細胞を保護する目的でも使われます。詳しく →を加えない状態で「粒子の外にある核酸」を測り、加えて粒子を壊した状態で「全体の核酸」を測る。この差から封入された分を求めます。原理そのものはシンプルですが、実務では気をつけどころが少なくありません。

外側と全体をどう測り分けるか、粒子径やPDI粒子径分布の広がりを表す指標。DLSで会合や凝集の傾向を早期に捉えるのに使う。とどう関わるか、規格をどう立てるか。EE％という一つの数字の裏には、こうした判断がいくつも積み重なっています。

封入率(EE%)は何を測っているのか

封入率は、LNPmRNAなどを包んで細胞へ届ける脂質の微粒子。全身投与では肝細胞に取り込まれやすい。に含まれる核酸のうち粒子内部に取り込まれた割合です。式としては、全核酸から外側（未封入）の核酸を引き、それを全核酸で割ったものになります。

ここで押さえておきたいのは、封入率は「入った割合」であって「入った絶対量」ではない点です。封入率が高くても、粒子に含まれる核酸の総量（薬物含量）が少なければ投与量は足りません。実務では封入率と核酸濃度を別々の指標として両方を管理します。mRNAワクチンの品質管理では、封入率、粒子径、界面電荷、脂質組成などが並列の管理項目品質に影響しうる要素を、規格や手順で規定し・実行し・記録し・検証する対象として管理するもの。GMPでは原材料から出荷判定まで多岐にわたります。詳しく →として扱われます。

封入率は割合を示す指標であり、核酸の絶対量である薬物含量製品にどれだけの目的物質が含まれるか（含量）や、その生物学的な効き目の強さ（活性）を示す指標です。培養液中の産生量を指す場合もあります。詳しく →とは切り分けて管理する必要があります 。

RiboGreenアッセイの原理：外側と全体を測り分ける

RiboGreenDNAやRNAに結合して蛍光を出す色素です。核酸の量を高感度で測ったり、電気泳動で見えるようにするために使います。詳しく →は、核酸に結合したときに蛍光が大きく増える色素です。遊離の状態ではほとんど光らず、RNAに結合すると強く発光する。この性質に加え、色素が粒子膜を通り抜けにくいこと（膜非透過性）を組み合わせることで、外側と全体を測り分けます。

• 界面活性剤なし⁠：色素は粒子の中まで入れないため、外側にある未封入核酸だけを検出します。
• 界面活性剤あり⁠：Triton X-100などで粒子膜を壊すと、内部の核酸が放出され、全核酸を検出できます。

この二条件の蛍光値を、それぞれ検量線既知濃度の標準から作る定量の基準線。qPCRでサンプル中のDNA量を読み取るのに使う。（既知濃度の核酸標準で作る）で濃度に換算し、差を取れば封入分が求まります。同じ試料を界面活性剤の有無で並行して測るのが、基本の設計です。

界面活性剤の役割は、粒子を確実に壊し、内部の核酸を色素がアクセスできる状態にすることです。分解が不十分だと全核酸を過小評価し、封入率を実際より高く見せてしまいます。一方で、界面活性剤が蛍光の背景を上げたり、処方中の脂質・添加剤が色素と核酸の結合を妨げたりする場合もあるとされており、条件は処方ごとに確かめる必要があります。近年はTriton X-100の代替となる界面活性剤の検討も進んでいます。

RiboGreenアッセイは色素の膜非透過性を使い、界面活性剤の有無で外側の核酸と全核酸を測り分ける差分法です 。

測定でつまずきやすいところ

原理は単純でも、実測ではいくつかの落とし穴があります。

• 粒子の分解の程度⁠：粒子が完全に壊れていないと全核酸を過小評価します。処方が変われば、壊すのに必要な界面活性剤の種類・濃度も見直しが要ります。
• 検量線の範囲⁠：RiboGreenには高濃度用と低濃度用の設定があり、試料濃度が範囲に収まるよう希釈します。範囲を外れると定量がゆがみます。
• 核酸ごとの応答差⁠：RNAとDNA、一本鎖と二本鎖で応答が異なるため、標準物質は測る核酸に近いものを選びます。
• バッファーと純度製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →⁠：規定のバッファー条件で行い、RNaseの混入を避けます。分解した核酸は正しく評価できません。

値の絶対水準よりも、同じ手順で繰り返し測ったときのばらつきの小ささ（再現性）が、規格運用では本質的に効いてきます。RiboGreen法以外に、イオン交換クロマトグラフィー電荷の違いで分けるイオン交換クロマト。酸性・主・塩基性ピークとして電荷バリアントの量を管理する。で外側の核酸を分離・定量する手法もあり、直交する原理ウイルス安全性確保において、除去・不活化などの異なる物理化学的原理を持つ複数の工程を組み合わせてマージンを積み上げる設計概念。での確認に使われます。

粒子径・PDIとの関係

封入率は単独で見るより、粒子径やPDIと合わせて眺めると処方の状態がよく分かります。粒子の物理的な性質はLNPの粒子径・PDIの記事で詳しく扱いますが、封入率との関係だけここで触れておきます。

mRNAワクチンでは、おおむね数十〜200 nm程度の粒子径が扱われます。PDI(多分散指数)は粒子径のばらつきを表し、均一なほど小さくなる。均一性の目安として、PDIを一定値以下（たとえば0.2〜0.3程度以下）に置く運用が広く見られます。

製造条件（混合の速さ、脂質と核酸の比率、pHなど）が崩れると、粒子径・PDIと封入率が同時に悪化することがあります。封入率が下がったとき、粒子径やPDIも一緒に動いているかを確認すると、原因がプロセスのどこにあるかを推定しやすくなります。これらは一体で、mRNA-LNPの製造プロセスの設計と密接に結びついています。

封入率は粒子径・PDIと連動して動くことが多く、三つを合わせて見ると処方や製造条件の変調を早く捉えられます 。

規格の考え方

封入率にどんな規格を置くかは、モダリティ抗体・低分子・核酸・細胞治療など、医薬品の種類・創薬手法の区分。や投与経路、開発段階によって変わります。mRNAワクチンでは高い封入率が求められる傾向があり、公開情報では85〜90％以上を目安とする記述が見られます。ただしこれは処方や目的によって異なる目安であり、一律の閾値があるわけではありません。規格値は、臨床で有効性・安全性が確認されたロットの実績（プロセスケイパビリティ）に基づいて設定するのが基本です。

規制側の枠組みでは、封入率は送達システムの品質特性の一つとして、重要品質特性製品の有効性や安全性に直結し、規格で管理すべき品質特性。空実比や純度、凝集体などが該当する。(CQA製品の有効性や安全性に直結し、規格で管理すべき品質特性。空実比や純度、凝集体などが該当する。)に位置づけられることが多い項目です。USP米国で医薬品・原料・試験法の公式基準を定める公定書で、製薬用水に関する規格も収載されている。はmRNAワクチン・治療薬の品質分析手順に関するドラフトガイドラインを整備しており、封入率の測定もその対象に含まれます。

封入率の規格は一律の閾値ではなく、有効性が確認されたロットの実績と測定のばらつきを踏まえ、他の品質特性と併せて設定します 。

まとめ

LNPの封入率(EE％)は、投入した核酸のうち粒子内に取り込まれた割合を示す基本指標です。RiboGreenアッセイは、核酸に結合すると光る色素の膜非透過性を利用し、界面活性剤の有無で外側の核酸と全核酸を測り分ける差分法で封入率を求めます。原理は単純でも、粒子の分解の程度、検量線の範囲、核酸の種類ごとの応答差、純度管理と、値を正しく出すための条件は少なくありません。

封入率は単独で完結せず、薬物含量、粒子径、PDIと合わせて見ることで処方や製造条件の状態が読めてきます。規格は一律の閾値を当てはめるのではなく、有効性が確認されたロットの実績と測定のばらつき、直交手法での確認を踏まえて組むのが実務的な進め方です。

参考文献

• USP, Analytical Procedures for Quality of mRNA Vaccines and Therapeutics (Draft Guidelines)
• ICH Q6B生物薬品の規格・試験方法の設定の考え方を示すICHガイドライン。力価などの規格を扱う。, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
• ICH Q8医薬品開発とQbDの考え方を示すICHガイドライン。重要品質特性（CQA）を定義している。(R2), Pharmaceutical Development
• WHO, Biological standardization and vaccine quality resources
• FDA, Vaccines and Related Biological Products guidance