RiboGreenアッセイでmRNA-LNPの封入率(%EE)を測る

RiboGreenアッセイは、RNAに結びつくと強く光る色素を使って、mRNAのうち脂質ナノ粒子mRNAなどの核酸を封入して細胞へ送達する脂質の微粒子。mRNAワクチンで大規模に実用化された非ウイルス系。詳しく →に包まれている割合（封入率、%EE）を求める試験です。粒子の外にあるmRNAと、粒子を壊して出した全部のmRNAを測り分け、その差から割合を出します。

ただし、封入率は同じロットを測っても、粒子を壊すのに使う界面活性剤の種類や濃さで変わることがあります。粒子を壊しきれないと全部のmRNAが少なく出るため、壊す工程の条件がそのまま数字に表れます。

この記事では、測定の仕組み、数字を動かす界面活性剤の条件、Triton X-100とEUの化学物質規制、粒子を壊さずに測る新しい装置、手順書作業の手順を定めた文書。品質システムの要素を具体化し、査察でも運用が確認される。詳しく →や報告書で確かめることを順に説明します。

1. 「LNPの外」と「全部」を数える仕組み

RiboGreenは、それだけではほとんど光らず、RNAに結合したときだけ強く光る色素です。代表的な製品はThermo Fisher ScientificのQuant-iT RiboGreen RNA Assay Kitで、1 mLあたり1 ngというごく薄いRNAまで測れます。

この色素は粒子の内側に抱え込まれたRNAまではほとんど届かないため、粒子を壊さないかぎり、光るのは外にあるRNAだけです。この性質を使って、脂質ナノ粒子（LNP）mRNAなどを包んで細胞へ届ける脂質の微粒子。全身投与では肝細胞に取り込まれやすい。の外のRNAと全部のRNAを測り分けます。

測定では、同じ試料を次の2つの条件で測ります。

• 界面活性剤なし⁠：粒子を壊さずに測り、LNPmRNAなどを包んで細胞へ届ける脂質の微粒子。全身投与では肝細胞に取り込まれやすい。の外にある遊離RNA（封入されていないRNA）の量を求めます。
• 界面活性剤あり⁠：界面活性剤で脂質をばらばらにして粒子を壊してから測り、中身も含めた総RNAの量を求めます。粒子を壊すこの操作を、可溶化と呼びます。

総RNAのうち、遊離RNAでなかった分の割合が封入率です。

2つの条件で測るだけなので、マイクロプレートに並べてプレートリーダーにかければ、何十検体も一度に読めます。この手軽さから、処方の条件を大きく変えて試す開発初期のふるい分けで広く使われています。

封入率はmRNAワクチンの出荷試験で見る数字の1つでもあり、開発の現場だけでなく、規制当局の試験でも使われています。

オーストラリアの規制当局TGA（薬品・医療機器の審査や品質試験を担う機関）は、2021年2月から2024年7月までに国内へ供給されたmRNAワクチン167ロットを自らの試験所で確認し、封入率もその確認項目に入れていました。結果は、すべてのロットが規格に適合していたと公表されています。

TGAが情報公開請求に応じて出したコミナティの試験記録にも、蛍光法で測った封入率の値が載っています。

蛍光で測る封入率は、開発のふるい分けにも、製品の出荷の判定にも使われています。

2. 数字を動かす界面活性剤の条件

封入率の数字がずれるときに最初に確かめるのは、界面活性剤が粒子を壊しきれているかです。

可溶化が不十分だと壊れないまま残る粒子があり、その中のRNAは総RNAに数えられないため、総RNAが少なく出ます。遊離RNAの量は変わらないので、計算した封入率は実際より低く出ます。

そのため、mRNAを十分に封入できている処方でも、粒子が可溶化しにくいと封入率が低く見えることがあります。

長く標準として使われてきた界面活性剤はTriton X-100ですが、公開されている手順書を見比べると、加える濃度も、温める時間も、手順ごとにまちまちです。

この点を実際に確かめたのが、デンマーク工科大学のSchultzらが2024年に発表した研究です。Triton X-100と、環境への負荷が少ないとされる3種類の界面活性剤（Brij 93、Zwittergent 3-14、Tween 20）について、濃度を200倍の幅で変えながら、LNPからmRNAをどれだけ取り出せるかを比べました。

いちばん安定して取り出せたのはTween 20で、試したすべての濃度で効いていました。最も高い濃度では、Tween 20とZwittergent 3-14がTriton X-100と同等以上で、著者らは、Triton X-100の代わりにTween 20を使えると結論づけています。

このように、界面活性剤の種類や濃度を変えると、同じロットのLNPでも封入率の数字は変わりえます。処方が変われば溶けやすさも変わるため、前の処方で十分だった条件が、次の処方でも十分とは限りません。

見落としやすい点が、ほかに2つあります。

• 検量線既知濃度の標準から作る定量の基準線。qPCRでサンプル中のDNA量を読み取るのに使う。詳しく →⁠：濃さの分かっているRNAで、蛍光の強さと濃さの対応を表したものを検量線と呼びます。試料と違う液で作った検量線で読むと、液の違いがそのまま数字のずれに乗るおそれがあるため、多くの手順書は界面活性剤なしの液とありの液で別々に作っています。
• 測定範囲⁠：可溶化した側の蛍光が検量線の上限を超えると、やはり総RNAが少なく出ます。範囲に収まるよう薄める量は希釈計算ツールで見積もれます。

なお、RiboGreenはRNA専用の色素ではありません。メーカーのマニュアルには、DNAにも結びつくこと、DNAが混ざる試料ではDNA分解酵素（DNase）で先に処理すればRNAだけを測れることが書かれています。

3. Triton X-100とEUの化学物質規制

Triton X-100は、EUの化学物質規制で2021年から使える用途が限られており、試薬を手配する購買や、海外拠点とのやりとりにも関わります。

Triton X-100は、オクチルフェノールエトキシレートという物質群に入ります。この物質群は、環境中で内分泌かく乱作用（生き物のホルモンの働きを乱す作用）を持つとして、EUの化学物質規制REACHの認可対象リストに載りました。

2021年1月4日以降、EU域内では、認可を受けた用途か、適用除外に当たる用途でなければ使えません。研究室で少量を使う分析は、科学的研究開発としての適用除外に当たる場合もありますが、どこまでを除外と見るかは、会社や拠点ごとに判断や方針が分かれます。

このため、EUの拠点や委託先と手順をそろえる場面では、界面活性剤の種類が食い違っていないかを先に確かめる必要があります。先の研究のとおりTween 20は代わりの有力な候補ですが、界面活性剤を替えれば、封入率の数字が動くおそれがあります。

切り替えるときは、同じロットを旧条件と新条件で並べて測り、値の対応を確かめてからにするのが安全です。

出荷試験に使っている方法なら、試験法の変更として社内の変更管理の手続きも必要です。承認を受けた製品で、その試験法が承認書に書かれているなら、当局への手続き（日本では一部変更承認申請や軽微変更届）が要るかどうかも確かめます。

手順を別の拠点へ移すときの考え方は、分析法の移管で解説しています。

界面活性剤を替える話が出たら、試薬の手配ではなく試験法の変更として扱います。

4. 粒子を壊さずに測る新しい装置

可溶化の条件で数字が変わる問題を避けるため、粒子を壊さずに総RNAを測る装置も出てきました。

Unchained Labsが2025年に発売したStunner AFは、総RNAを紫外可視の吸光で測り、界面活性剤で粒子を壊しません。濁った液では光が散らばって吸光の値が狂いやすいのですが、コレステロールや濁りの影響を計算で差し引き、RNAの分だけを取り出すとメーカーは説明しています。

遊離RNAは色素の蛍光で測り、粒子の大きさも同じ測定で読めます。2 µLほどの試料で済むため試料の少ない開発初期に向いており、発売の経緯はStunner AFのニュースにまとめています。

もう1つは散乱フリー吸収分光（SFA）です。試料を積分球（内側が光をよく反射する球）の中に置き、散らばった光も拾い戻すことで、濁ったままのLNPからRNA量を求めます。詳しくはSFAのニュースで紹介しています。

どちらも、可溶化の条件で数字がぶれる問題を避けられる点に利点があります。ただし、新しい方法の値がRiboGreenの値とそのまま一致する保証はなく、メーカーが示しているのは、メーカーが選んだ試料での結果です。

自社の処方で同じロットをRiboGreenと並べて測り、差がどのくらいあるかを確かめてから使い分けを決めます。規格の数字をどちらの方法の値で決めるかも、そのときに決めておきます。

5. 明日から確かめられること

自社の手順書か、委託先の報告書を1部用意して、次の点を見てください。

1. 界面活性剤の条件⁠：界面活性剤の名前、濃度、反応させる時間と温度が書かれているかを見ます。
2. 検量線と測定範囲⁠：検量線を、界面活性剤なしの液とありの液で、それぞれ試料と同じ液で作っているかを見ます。可溶化した側の蛍光の強さが、検量線の範囲に収まっているかも確かめます。
3. DNAの前処理⁠：DNAが混ざる試料なら、DNA分解酵素（DNase）で先に処理しているかを見ます。
4. 界面活性剤の切り替え⁠：Triton X-100を使っている場合は、EUの拠点や委託先と同じ界面活性剤かを確かめます。替えたなら、同じロットで新旧を並べて測った記録があるかを見ます。
5. RNAの総量⁠：封入率と並べて、RNAの総量（含量）も見ているかを確かめます。

条件が書かれていない封入率は、ほかの数字と比べられません。委託先の報告書で封入率を受け取る品質保証の担当者も、営業や購買の立場で取引先から封入率を聞いたときも、数字と一緒に測った条件を確かめると、比べられる数字かどうかを見分けられます。

粒子を壊さない装置を検討するなら、メーカーの公表データだけで決めないでください。自社の処方の同じロットでRiboGreenとの差を確かめ、規格をどちらの値で決めるかまで詰めてから導入を判断します。候補の装置はLNP粒子特性評価の製品一覧で比べられます。

封入率が急に下がったときは、処方や製造を疑う前に、界面活性剤の調製と検量線を確かめ直します。製造をやり直すより、はるかに少ない手間で確かめられます。

封入率は割合なので、RNAの量そのものは別に管理します。その考え方はLNPの封入率(EE%)測定で解説しています。

封入率の数字を受け取ったら、値より先に、測った条件を確かめてください。

参考文献

• Thermo Fisher Scientific, Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit（User Guide, MP11490）（測定できる濃度範囲、DNAへの結合とDNase前処理）
• Schultz D, Urquhart A, Münter RD, Masi A, Kempen P, Jahnke N, Andresen TL, Simonsen JB. Enhancing RNA encapsulation quantification in lipid nanoparticles: Sustainable alternatives to Triton X-100 in the RiboGreen assay. Eur J Pharm Biopharm. 2024;205（PMID 39490428）: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39490428/
• TGA, Quality assurance and control test results: COVID-19 mRNA vaccines (Pfizer and Moderna)（TGA Laboratory testing report）（2021年2月〜2024年7月供給の167ロット）
• TGA, FOI 3471 公開文書（コミナティの試験記録、蛍光法による封入率）: https://www.tga.gov.au/sites/default/files/foi-3471-34.pdf ／ https://www.tga.gov.au/sites/default/files/foi-3471-48.pdf
• Commission Regulation (EU) 2017/999 of 13 June 2017 amending Annex XIV to Regulation (EC) No 1907/2006（REACH）（オクチルフェノールエトキシレートの認可対象リスト入り、日没日2021年1月4日）。科学的研究開発の定義はREACH第3条(23)、認可の適用除外は第56条(3)。解説は MedTech Europe, Latest amendment of the 'Authorisation List' of REACH Regulation
• Unchained Labs, Lipid Nanoparticle Encapsulation Efficiency ／ Skip the mess with dye free LNP payload quant on Stunner（Application Note）（メーカー公表情報）