微生物・発酵基礎知識・培養

微生物の株構築とセルバンクとは？選択マーカーと凍結保存の落とし穴

Proglenth 編集部公開 2026-07-16更新 2026-10-09約6分で読めます

大腸菌や酵母で生産株を作ると、最初によく発現したクローンを選んだ時点で、仕事が片づいた気がします。ところが量産のスケールに進むと、同じクローンのはずなのに発現量が落ちることがあります。原因は宿主でも配列でもなく、選択圧（プラスミドを持つ細胞だけが生き残る条件）を外した途端に崩れる設計を、量産の直前まで誰も疑わなかったことにある場合が少なくありません。

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生産株は、いったんセルバンクとして固定すると、何年も先のロットまで、そこが製造の起点です。上流でのわずかな設計の差が、量産の段階になって表に出るのは、このためです。株構築とセルバンクの仕事は、発現量を競うことより、崩れにくい設計を選ぶことと、固定したものを後から説明できる記録を残すことにあります。

開発の担当者だけでなく、受託先を選ぶ購買や品質保証、株や資材を提案する営業にとっても、どこで失敗が起きやすいかを知っていると、確認する点が絞れます。

発現の載せ方 ― プラスミドか、ゲノム組込みか

組換え遺伝子を宿主に持たせる方法は、大きく二つに分かれます。どちらを選ぶかで、そのあとの設計のほぼすべてが決まります。

プラスミド（細胞の中で独立に増える環状のDNA）は、コピー数を高くして遺伝子の量を稼ぎやすく、構築も速く進みます。ただし複製に代謝の資源を使うため、選択圧がなければ、世代を重ねるうちに失われやすいという弱点があります。ゲノム組込みはコピー数こそ増やしにくいのですが、選択圧がなくても保持され続けます。Pichia pastoris（メタノール資化性酵母）のAOX1遺伝子座への組込みが代表例です。

探索の段階では、プラスミドで一気に発現量を稼ぎます。長期に大スケールで安定して運転したい製造株では、ゲノム組込みか、低から中程度のコピー数の安定したプラスミドを選ぶのが実務の傾向です。どちらが正しいという話ではなく、開発初期の探索の速さと、量産後の世代を超えた安定性のどちらを取るかで、失敗したときに重くなる側が変わります。

発現の載せ方は、発現量を稼ぐ前に、選択圧を外したときにどちらが壊れにくいかで選びます。

抗生物質を使わない選択 ― 3つの方式と規制の事情

プラスミドを持つ細胞だけを選び出すには、選択マーカーが要ります。研究室では抗生物質耐性が定番ですが、製造では懸念を抱え込みます。耐性遺伝子が製品や環境に残らないか、抗生物質を工程のどこで除き、どう確認するか、耐性が広がらないか。FDAが以前に示した、プラスミドそのものを投与するDNAワクチン向けの指針は、アレルギー反応のおそれから、ペニシリンなどβラクタム系の耐性遺伝子を避け、マーカーが要るならカナマイシンなどを使うよう助言していました。欧州でも耐性マーカーを避ける方向が示されてきたため、製造株では、抗生物質を使わない選択が好まれます。

方式は主に三つです。必要な代謝遺伝子を宿主から欠失させ、プラスミド側に載せておく栄養要求性相補。染色体上の致死遺伝子を、プラスミド由来の抑制因子で抑えておくオペレーター/リプレッサー系。そして、プラスミド由来のRNAで致死遺伝子を抑えるRNAベースの方式です。

RNAベースの実例が、Aldevron（Danaher）のNanoplasmidです。150塩基対のRNA-OUTという短いRNAで、染色体上のSacB遺伝子（レバンスクラーゼ）の発現を抑えます。SacBはスクロースの存在下で細胞に毒性を示す酵素なので、プラスミドを失った細胞は、抑制が外れて死にます。抗生物質を使わずに選択圧を保てる設計です。

メーカーや受託先に聞くべきなのは、「抗生物質フリーに対応しているか」ではありません。「その選択圧は、凍結と解凍、再増殖を挟んでも同じ強さで働くか」です。

選択マーカーの設計は、効率よく選べるかではなく、製造とセルバンクの両方に持ち込めるかで決まります。

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プラスミドの不安定性 ― 世代を重ねると何が起きるか

プラスミド保持系で最も注意したいのが、プラスミド不安定性です。二つの仕組みで起こります。

一つは分配不安定性で、細胞分裂のときに、一部の娘細胞にプラスミドが受け渡されない現象です。もう一つは構造不安定性で、DNAの組換えや欠失で、組み込んだ遺伝子そのものが壊れる現象です。発現による負荷が大きいほど、プラスミドを失った身軽な細胞が増殖で有利になり、培養が進むほど、生産しない細胞が集団を占めていきます。

対策は四つあります。分配を安定化させる配列（par領域）を付けること、コピー数を適正にすること、抗生物質を使わない選択で保持する圧力を保つこと、そしてゲノム組込みに切り替えることです。実測は小型バイオリアクターで行い、選択ありと選択なしの両方の条件で世代を重ね、コロニー保持率（プラスミドを持つ細胞の割合）と発現量の推移を追います。

POINT

プラスミド不安定性は、選択圧を切った瞬間ではなく、継代を重ねるあいだに静かに進みます。安定性試験を1回だけ行うと、崩れ始める世代を見落とします。

最初によく発現したクローンではなく、選択圧を外して世代を重ねても発現を保つクローンを選ぶことが、製造スケールでの収量の安定につながります。

株を変えるとき ― 収量の裏で変わるもの、1989年のL-トリプトファン

生産株は、一度決めたら終わりではありません。収量を上げるために、改良した株へ切り替える場面があります。そのとき何が起きうるかを示す事例が、1989年の米国にあります。

必須アミノ酸のL-トリプトファンをサプリメントとして摂った人に、強い筋肉痛と好酸球（白血球の一種）の増加を起こす好酸球増多筋痛症候群（EMS）が広がりました。FDAは1989年11月、摂取をやめるよう全国に警告し、回収を求めています。報告された患者は1,500人を超え、30人以上が亡くなりました。患者の大半は、日本の昭和電工が発酵で作ったL-トリプトファンを摂っていました。

米国の疫学調査では、患者に結びついたロットで、製造の変更が重なっていました。収量を上げるために遺伝子を改変した株（Bacillus amyloliquefaciens）に切り替えたことに加えて、精製に使う活性炭の量を減らすなど、精製が簡略化されていたのです。製品からは60種類以上の微量な不純物が見つかり、そのうち6種類がEMSと関連していました。ただ、病気の原因になった物質が何かについては、今も議論が続いています。

原因物質が確定していなくても、教訓は残ります。株と精製が同時に変わると、どちらが影響したのか切り分けられません。収量の高い株は、副産物の顔ぶれも変わりうるため、株を作り替えるときは、旧株と新株で不純物の一覧を並べて比べ、精製や工程の変更は一度に一つずつ行います。

収量が上がった株は、不純物の顔ぶれも変わりえます。株と精製を同時に変えてはいけません。

セルバンク ― グリセロールでの凍結と、MCB・WCBの二段構え

凍結保存の資材を探すと、最初に目に入るのはDMSO系の製品です。ここで取り違えが起こりやすくなります。

BioLife SolutionsやSTEMCELL TechnologiesのCryoStor CS10は、DMSOを10%含みます。哺乳類の細胞向けの処方です。大腸菌や酵母のバンクで使う凍結保護剤は、グリセロールで、終濃度は15〜25%（v/v）に調整し、マイナス80 ℃級で保管するのが実務です。原料には、MerckのEMPROVE bioのように、薬局方に適合し低エンドトキシンをうたうグレードを使います。カタログでDMSO濃度を比べて選ぶのは哺乳類細胞の話で、微生物では、グリセロールの濃度と保管温度が見る先です。

生産株が決まったら、凍結ストックを二段階で体系化します。単一の生産クローンからマスターセルバンク（MCB）を作り、MCBの1バイアルから拡大培養してワーキングセルバンク（WCB）を作ります。日々の製造はWCBの1バイアルから始めるので、MCBを使い減らさずに、何度でも同じ出発点から作れます。この構造自体は、動物細胞のセルバンクと共通で、違いはMCBとWCBの違いで解説しています。作製から保管までを外部に任せる場合は、微生物セルバンク受託で比べられます。

バンクの試験は、ICH Q5D（細胞基材の樹立と特性解析）の考え方で、MCBには包括的な純度・同一性の試験を、WCBには限定した試験を行います。大腸菌のMCBなら、生存率、微生物学的な純度、同一性に加えて、プラスミドを保持している割合を確かめます。さらにICH Q5B(発現構築物の解析)は、製造で許される最後の世代、生産終了時細胞（EOPC）まで培養しても、挿入した配列やコピー数が保たれているかを、シーケンスなどで確かめることを求めています。