灌流のVVDはどこから決めればいい？答えは細胞1個あたりの量

灌流培養の運転条件を詰めるとき、まず「何 VVD で回すか」を決めにいく人は少なくありません。VVD（vessel volumes per day灌流速度を作業体積で正規化した槽体積回転数/日。1日に作業体積の何杯分を入れ替えるかを表す。詳しく →）は、槽の体積を1日に何回入れ替えるかを表す数字で、運転計画にそのまま書き込める扱いやすさがあります。ところが、これを出発点に置くと、細胞がいちばん増えた頃に培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。詳しく →が足りなくなることがあります。

なぜVVDを先に決めると培地が足りなくなるのか？

基準が槽であって、細胞ではないからです。水槽で魚を飼うとき、「1日に水槽1杯分の水を替える」と決めたとします。魚が倍に増えれば、1匹あたりの水は半分に減ります。VVDも同じ。槽を基準にした数字なので、細胞1個に何が届いているかは映しません。立ち上げの時期は細胞が増え続けるため、VVDを固定して運転すると、いちばん細胞が多い時期に栄養が足りなくなり、乳酸やアンモニアグルタミンの代謝と化学分解で生じる代謝副産物。蓄積すると増殖・生存を落とし、糖鎖の質にも影響する。詳しく →が溜まります。

だから先に置くのはCSPRです。CHO細胞抗体など組換えタンパク質の生産に広く使われる、チャイニーズハムスター卵巣由来の培養細胞です。詳しく →でよく語られるCSPR細胞1個が1日に必要とする培地体積を表す指標（pL/cell/day）。灌流速度や培地消費量の設計の土台になる。詳しく →は、1個あたり1日に20〜50ピコリットル（1兆分の1リットル）ほど。学会要旨には、1 mLあたり1億個を超える細胞を、22ピコリットルで培養した例もあります（Brau らの Cell Culture Engineering XVI 要旨。ミニバイオリアクターでの値）。この値に目標の細胞数を掛ければ、1日に要る培地の量が絶対量で決まり、それを槽の液量で割ったものがVVDです。自社の条件で試算するなら灌流のCSPR・灌流速度の計算ツールが使えます。

VVDは、細胞の数とCSPRを決めたあとに、結果として出てくる数字です。

VVDの上限は、保持装置と培地の濃さのどちらで決まるのか？

どちらも効きます。まず、VVDを上げたくても上げられない上限が1つ。細胞を槽に残したまま液だけを抜く細胞保持装置灌流培養で使用済みの培地を入れ替えつつ、細胞は培養槽に残すための装置です。中空糸膜などで細胞と液をより分けます。詳しく →が、通せる流量です。Repligen の XCell ATF や KrosFlo は中空糸（細い管状の膜）を使い、Merck の Prostak MF は平らな膜を積んだ構造で、どちらも膜の面積と目の細かさで通せる量が決まります。目標のVVDが装置の通せる量の内側に収まるかを、先に確かめておきます（ATFとTFFの違い）。

もう1つの分かれ道は、VVDを上げるか、培地を濃くするかという費用の判断です。VVDを上げれば細胞のまわりの環境は安定します。その代わり、培地の総量が増え、収穫液も薄まって精製で扱う液量も増えます。灌流向けに濃く作られた培地は1 Lあたりの値段が高い代わりに、少ないVVDで同じ栄養を届けられます。Thermo Fisher Scientific は Gibco High-Intensity Perfusion CHO Medium について、1 VVDの連続灌流で1 mLあたり1億個を超える細胞を支えられるとしています。

VVDを挟み込んでいるのは、保持装置の通せる量と、培地の濃さです。

明日から確かめられること

培養の設計担当なら、いま置いているVVDを、目標の細胞数とCSPRに分けて書き直してみてください。VVDしか書かれていない運転計画は、細胞が増えた時期に何が起きるかが読み取れません。

装置を担当する人は、その流量を運転の終わりまで通せるかを確かめます。購買の担当は、培地を粉末で買うか液体で買うか、1日に使う量に対して納期と保管の場所が足りるかを見ておきます。

確認チェックリスト

• CSPRと培地量⁠：目標の細胞の濃さと、置くつもりのCSPR。そこから出る1日の培地の量
• 保持装置⁠：その流量を、細胞保持装置が運転の終わりまで通せるか
• 代謝物の監視⁠：乳酸とアンモニアを毎日追い、CSPRを下げる手前で止める基準があるか
• 費用の比較⁠：VVDを上げる案と、濃い培地にする案を、製品1 gあたりの培地の量で比べたか

CSPRが培地の量と費用をどう決めるか、毎日の培地の調製・ろ過・保管で何が起きるか、CSPRを下げていく2つの道とよくある失敗は、CSPRとは？灌流培養で培地がどれだけ要るかを決める数字にまとめています。灌流という運転方式そのものの位置づけは灌流培養で、細胞を毎日抜いて濃さを保つ操作はセルブリード制御の解説で読めます。

参考文献

• Thermo Fisher Scientific（Gibco）, High-Intensity Perfusion CHO Medium 製品情報（1 VVDの連続灌流での細胞密度）
• Repligen, XCell ATF / KrosFlo 中空糸フィルター 製品情報（灌流培養培養液を連続的に入れ替えながら細胞を高密度に保ち、長期間生産を続ける培養方式です。細胞を装置で保持し、老廃物を除きつつ栄養を補給します。詳しく →の細胞保持と膜の目開き）
• Merck, Prostak Microfiltration Modules 製品情報（灌流培養の細胞保持と平膜の面積）
• Perfusion Medium Development for Continuous Bioprocessing of Animal Cell Cultures（CSPRと灌流培地設計の総説）
• Brau C, et al. Optimization and evaluation of perfusion media in high cell density mammalian cell culture systems（Cell Culture Engineering XVI 要旨。ミニバイオリアクターで1 mLあたり1億個超、CSPR 22 pL/cell/day）