デッドボリュームとは？同じカラムでピークが広がる原因と見直し方

カラムも試料もメソッドも同じなのに、別の装置で流したらピークがブロードになり、隣り合うピークの谷が浅くなった。こういうとき、カラムの劣化を疑って新品に替える前に、カラムの外にある配管や部品を見てください。

カラムで分離した成分のバンドは、カラムを出てから検出器に届くまでのあいだに、再び拡がります。分離に関わらない流路の容積がデッドボリューム（dead volume、死容積）で、これが大きいほどバンドの拡散が進みます。細い配管に替える、短くする、接続のすき間をなくす。こうした地味な見直しが、カラムの買い替えより効くことがあります。分析の担当だけでなく、装置を選ぶ購買や、配管の変更を管理する品質保証にも関わる話です。

1. デッドボリュームは、分離・保持時間・スケールのどこで表に出るのか？

装置を替えたときの分離の悪化、保持時間のずれ、スケールを変えたときの分離の違い、の三つです。

• 分離の悪化⁠：ピークがブロードになると、隣のピークとの谷が浅くなる。凝集体の割合を求めるサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）多孔性樹脂の孔に小分子ほど入り込む時間差を利用し、分子をサイズで分けるクロマトグラフィー。詳しく →のように、モノマーのすぐ隣の小さなピークを測る分析では、積分の境界が動いて、報告する数字がぶれる。
• 保持時間のずれ⁠：同じグラジエントグラジエントとは、クロマトグラフィーで移動相の組成（塩濃度、pH、有機溶媒の割合など）を変えていき、保持された成分を順に溶出させる操作です。変え方には連続的なものと段階的なものがあり、タンパク質の精製では、担体に結合したタンパク質を結合の弱いものから順に溶出させます。詳しく →のメソッドを別の装置で走らせると、溶出時間が揃わないことがある。分析法の技術移転でよく起きる。
• スケールの変更⁠：小さなカラムで再現できた分離が、大きなカラムでは違って見える。あるいは、スケールダウンモデルが実機と合わない。

「カラムは同じなのに結果が違う」と聞いたら、流路の違いを先に確かめます。

2. カラムを出たバンドは、なぜ拡がってピークがブロードになるのか？

カラムの外の流路では、管の中心と壁ぎわで流速が違い、そこに拡散が加わって、バンドが前後に引き伸ばされるからです。

カラムの中で分離した成分は、狭いバンドになって出てきます。このバンドが検出器に着くまでに通る空間が広いほど、引き伸ばしは大きくなります。細い管の中では、中心は速く、壁ぎわは遅く流れます。同時にカラムを出た分子でも、流れる位置によって到着時刻がばらつきます。

配管の内径は、特に強く効きます。同じ流量での目安は次のとおりです。

流路を見直すときは、まず内径、次に長さの順で見ます。ただし細くすれば圧力損失が増えます。分析用の装置では背圧の上限が、製造では送液の負荷が、細さの限度を決めます。

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小さなカラムほど影響を受けやすい点にも注意が要ります。カラムが小さいと、ピークの体積そのものが小さくなるので、同じ配管でも広がりが占める割合が大きくなります。細径のUHPLCカラムや、RoboColumn微量の担体を詰めた超小型カラムで、自動分注ロボットに載せて多数の精製条件を並行で試すハイスループットスクリーニングに使います。詳しく →のような小容量のカラムで、流路の寄与が目立つのはこのためです。

3. 重要：デッドボリュームは、配管以外のどこに潜んでいるのか？

見落とされやすいのは接続部のすき間です。ほかにも、カラムの前後に並ぶ部品がそれぞれ容積を持っています。

チューブの交換や継手の付け替えのたびに、端が奥まで届いているかを見る習慣が、再現性を支えます。

デッドレグは、同じ形が別々の問題として現れます。

• クロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。詳しく →⁠：分離を乱す要因。
• 無菌医薬品の製造⁠：洗浄や殺菌が届かない箇所。

4. グラジエントの遅れとスケールの変更で、装置の違いはどう出るのか？

グラジエントでは保持時間のずれとして、スケールの変更ではカラム容積と流路容積の比の変化として出ます。

ポンプの混合部からカラムの入口までの容積は特別な意味を持ち、ディレイボリューム（dwell volume）と呼ばれます。グラジエントで設定した組成の変化が、この容積を満たすぶんだけ遅れてカラムに届くからです。装置ごとにこの容積が違うので、同じメソッドでも保持時間がずれます。

移転先で保持時間が合わないとき、カラムやバッファを疑う前に、両方の装置のディレイボリュームを比べてください。差が大きければ、グラジエントを始める前のイソクラティックの保持時間を足し引きして合わせる、という調整がよく行われます。USP〈621〉は、クロマトグラフィーのシステム適合性試験系がきちんと動いていることを確認するための基準や試験。判定の信頼性を支える。詳しく →と、認められる調整の範囲を定めています。進め方は分析法の技術移転にあります。

スケールを変えるときの論点は、カラムの容積と流路の容積の比が変わることです。クロマトグラフィーのスケールアップではカラム径を大きくしてベッド高を保つのが基本ですが、装置側の配管容積が同じ比率で増えるとは限りません。スケールダウンモデルでは逆に、小さなカラムに対して流路の容積が相対的に大きくなり、実機を再現したつもりで別の分離になっていることがあります。

カラムの充填性能試験（理論段高さカラム充填の良し悪しを示す指標で、値が小さいほど分離効率が高い。充填品質の確認に使う。詳しく →（HETP）や、ピークの対称性を表す非対称度の測定）にも同じ落とし穴があります。この試験は配管込みで測るので、流路が違えば、同じカラムでも値が変わります。合格範囲はレジンクロマトグラフィーで目的物や不純物を結合させる粒子状の充填材。精製モードごとに使い分ける。詳しく →とカラムのメーカーが指定する値に従い、非対称度では0.8〜1.5前後がよく使われます。ただ、その数字を見る前に、どの流路で測った値かを確かめます。

送液の途中にホールドタンクやインライン希釈濃縮ストックを運転時に水と一定比率で合流させ、規定濃度のバッファを作りながら流す方式。詳しく →が入る系では、バッファのインライン調製で設定した組成が、実際にカラムへ届くまでの遅れも考慮します。

5. 分離が変わったとき、流路の何を確かめるのか？

流路容積の資料、変更の記録、継手の接続、流路だけの広がり、ディレイボリュームの差です。

分離がいつもと違うときや、装置を替える前に、次の点を確認してください。

• 流路容積の資料⁠：カラム前後の配管の内径と長さ、フローセルの容積、混合部からカラムまでの容積（ディレイボリューム）が、装置ごとに分かる資料はあるか
• 変更の記録⁠：配管やフローセルを替えたとき、記録が残り、変更管理工程・設備・手順などの変更を評価・承認し、品質への影響とともに記録する仕組み。詳しく →に乗っているか
• 継手の接続⁠：継手を付け替えるたびに、チューブの端が奥まで届き、内径の違う接続になっていないかを見ているか
• 流路だけの広がり⁠：装置を替える前に、カラムの代わりに接続部だけをつけて同じ試料を流し、流路だけの広がりを比べたか
• ディレイボリュームの差⁠：保持時間のずれは、両方の装置のディレイボリュームの違いで説明できるか

購買や営業の人は、装置を比べるとき、流量範囲や圧力の仕様に加えて、カラム前後の流路容積とフローセルの容積をメーカーに尋ねると、装置どうしを同じ土俵で比べられます。装置はクロマトグラフィーシステム、小型のカラムはプレパックドカラムやRoboColumnのページで探せます。

参考文献

• USP米国で医薬品・原料・試験法の公式基準を定める公定書で、製薬用水に関する規格も収載されている。詳しく →, General Chapter〈621〉Chromatography
• USP, 〈621〉Chromatography（Stage 4 Harmonization Official Text）
• USP, FAQs: Chromatography
• European Commission, EudraLex Volume 4, Annex 1: Manufacture of Sterile Medicinal Products（衛生設計とデッドレグの考え方）