iPS細胞から作った細胞の純化とは？残った未分化細胞はなぜ問題で、どう見つけるのか
iPS細胞体細胞を初期化して作る多能性幹細胞。同一株から繰り返し分化・製造でき均質性を高めやすい。詳しく →から作った細胞の純化とは、分化させた細胞の中から、目的外の細胞と、分化しきらずに残ったiPS細胞を減らす工程のことです。移植する細胞の安全性に直接かかわるため、細胞を作る人にも、その品質を確かめる人にも関係します。
ただし、純化をしても、残った未分化細胞がゼロになったとは言えません。そのため、どこまで少ないかを検査で示す必要があります。
この記事では、目的外の細胞が混ざる理由、純化の方法、残った未分化細胞が問題になる理由と見つけ方、自分の工程で確かめる順番を順に説明します。
- 純化とは：分化させた細胞の中から、目的外の細胞と残ったiPS細胞を減らす工程です。心筋では乳酸を使える代謝の違い、神経の前駆細胞では表面の目印を使う例があります。
- 残ったiPS細胞はなぜ問題か：移植したあとに体の中で増え、奇形腫などの腫瘍をつくるおそれがあるためです。
- どう見つけるのか：未分化の細胞に特有の目印や遺伝子の発現を測るか、培養や動物への移植で増える力を見ます。見つけられる下限は方法によって桁で違い、1つの報告の数字を一般化できません。
1. なぜ目的の細胞以外が混ざるのか
iPS細胞を目的の細胞へ変える（分化させる）とき、すべての細胞が目的の細胞になるとは限らず、できた集団には目的外の細胞が混ざります。同じ薬剤を同じ順番で与えても、別の系統へ進む細胞や、未分化のまま残る細胞が出るためです。この工程を分化誘導幹細胞を、発生過程を模した因子の切り替えによって神経・心筋など目的の細胞へ段階的に方向づける操作。詳しく →と呼び、その仕組みはiPS細胞の分化誘導で説明しています。
そのため、分化を終えた時点の細胞は、次の3種類が混ざった集団です。
- 目的の細胞：移植に使う細胞で、心筋の細胞や、神経のもとになる前駆細胞などが当てはまります。
- 目的外の細胞：途中で別の系統へ進んだ細胞です。移植先で余計に増えたり、目的と違う働きをしたりするおそれがあります。
- 残ったiPS細胞：分化しきらずに未分化のまま残った細胞で、残存未分化細胞iPS細胞などに由来する製品で、分化しきらず腫瘍化する恐れのある細胞が残っていないか調べる安全性評価です。詳しく →とも呼ばれます。
移植する細胞の品質を決めるのは、目的の細胞の割合だけでなく、残りの2種類がどれだけ少ないかです。
このように、分化を終えた細胞は混ざった集団として扱い、要らない細胞を減らす工程と、残った量を確かめる工程を置きます。では、目的の細胞だけを残すには、どうするのか。
2. 目的の細胞だけを残すにはどうするのか
目的の細胞だけを残すには、目的の細胞とそれ以外の細胞の性質の違いを使い、要らない細胞を減らします。使う性質によって、方法は次の3つに分かれます。
- 代謝の違いで選ぶ：心筋の細胞は、ブドウ糖が無くても乳酸をエネルギー源にして生き残れますが、iPS細胞を含むほかの細胞はこの条件で生き残れません。この違いを使い、ブドウ糖を抜いて乳酸を加えた培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。詳しく →で心筋だけを残す方法を、乳酸による純化（代謝選別）と呼びます。
- 表面の目印で選ぶ：目的の細胞の表面に出るタンパク質に、蛍光の色素や磁気ビーズ抗CD3/抗CD28抗体を結合させた磁性粒子。T細胞を活性化しつつ磁場で選択するのに使う。詳しく →を付けた抗体を結合させ、その細胞だけを分け取ります。蛍光で1個ずつ見分けて分ける装置が、セルソーターです。
- 残ったiPS細胞だけを除く：iPS細胞のような多能性幹細胞さまざまな細胞へ分化できる能力を持つ幹細胞。オルガノイドなどの出発材料になる。詳しく →の表面にだけ結合するタンパク質（レクチン）に毒素をつなぎ、培地に加えて除いた報告があります（Tateno 2015）。
どの方法も、目的の細胞か未分化の細胞にだけある性質が、前もって分かっていることが前提です。
Tohyamaらの2013年の報告では、乳酸による純化で心筋の純度製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →が最大で99%に上がりました。純化した心筋を動物に移植しても、腫瘍はできていません。遺伝子を改変せず、培地を替えるだけで済むため、大量の細胞をまとめて純化できます。
表面の目印の例が、パーキンソン病に向けたドーパミン神経の前駆細胞で、中脳の底板の細胞に出るタンパク質CORINを目印に選びます。Doiらの2014年の報告では、CORINで選ぶと、目的の前駆細胞の割合が全体の47%から76%に上がりました。京都大学の臨床試験でも、CORINで選んだ細胞が移植されています（Sawamoto 2025）。
つまり、純化の方法は目的の細胞が持つ性質で決まり、ここで挙げた報告でも、目的の細胞の割合は100%に届いていません。使える性質が無ければ、分化の効率を上げて、目的外の細胞を最初から減らす工夫が要ります。では、残ったiPS細胞は、なぜそれほど問題になるのか。
3. なぜ残ったiPS細胞が問題になるのか
残ったiPS細胞は、移植したあとに体の中で増え、奇形腫多能性幹細胞が体内で増え、複数の組織が混じって形成される腫瘍。残存未分化細胞のリスク指標になる。詳しく →などの腫瘍をつくるおそれがあります。奇形腫（テラトーマ多能性細胞が体内で複数種の組織を含む腫瘍を作る現象。残存未分化細胞による造腫瘍性の代表例。）とは、体の組織のもとになる3つの層（胚葉）のうち、2つ以上に由来する組織が混ざってできる腫瘍のことです。分化を終えた目的の細胞と違い、iPS細胞は増え続ける力と、どの胚葉の組織にもなれる力（多能性）を保っています。
残ったiPS細胞は、数が少なくても見過ごせません。人の細胞を拒絶しない重い免疫不全のマウスに、iPS細胞だけを足場のゲルと一緒に皮下へ移植した報告があります。約130個で、半数のマウスに腫瘍ができました（Kanemura 2014）。
しかも、心不全の患者1人には、少なくとも10億個（10⁹個）の心筋細胞が要るという見積もりがあります（Kuroda 2015）。この量なら、0.001%の混入でも1万個のiPS細胞にあたります。
一方で、残ったiPS細胞がゼロだと、測定で示すことはできません。検査で示せるのは、その方法で見つけられる最も少ない量（検出の下限）より少ない、というところまでです。厚生労働省の2019年のガイドライン（留意点）も、中間製品（製造途中の細胞）と最終製品に混ざる未分化のiPS細胞の量を、品質特性として評価し管理することが必要だとしています（5.2）。
つまり、残ったiPS細胞は、どの方法でどこまで少ないと言えるかを、投与する細胞の数と合わせて示す必要があります。では、その量はどうやって測るのか。
4. どうやって見つけるのか、方法で何が違うのか
残ったiPS細胞は、未分化の細胞に特有の目印や遺伝子の発現目的タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で転写・翻訳させ、機能的なタンパク質として産生させる工程。詳しく →を測るか、培養や動物への移植で増える力を見て見つけます。見つけられる下限は、方法によって桁で違います。
検出の下限とは、目的の細胞にiPS細胞をわざと決まった割合で混ぜた試料を作り、どこまで薄くしても見つけられたかを表す値です。そのため、報告の数字は、混ぜた相手の細胞と測り方の条件とを組にして読みます。
| 方法 | 何を見るか | 報告された検出の下限（混ぜた相手の細胞） | 結果までの目安 |
|---|---|---|---|
| 動物への移植（造腫瘍性試験） | 免疫不全マウスの皮下で腫瘍ができるか | 0.4%（網膜色素上皮網膜の外側にある色素を持つ上皮細胞。iPS細胞からの分化誘導で作られ、再生医療での臨床応用が進む系統。詳しく →の細胞。50%の確率で検出） | 17〜30週間 |
| 軟寒天でのコロニー形成 | 足場の無い寒天の中で増える細胞 | iPS細胞は検出できない | 3〜4週間 |
| フローサイトメトリー細胞を一つずつ測定し、表面マーカーや性質を調べる手法です。細胞の種類・純度・活性の確認に使います。詳しく → | 細胞1個ずつの表面にある未分化の目印（TRA-1-60） | 0.1%（網膜色素上皮の細胞） | 1日 |
| qRT-PCR | 未分化の細胞で働く遺伝子（LIN28）のmRNAの量 | 0.002%以下（網膜色素上皮の細胞） | 約6時間 |
| デジタルPCR反応液を無数の微小区画に分けて増幅し、陽性区画の数から核酸の量を絶対値で数える装置です。ごく微量の検出や定量に強みがあります。詳しく → | 同じLIN28のmRNAを、1分子ずつ数える | 0.001%（心筋細胞） | 約6時間 |
| 培養して増やす方法 | 増えやすい条件で培養し、iPS細胞の塊（コロニー）ができるか | 0.001〜0.01%（間葉系幹細胞免疫抑制や組織修復に働く体性幹細胞。免疫や炎症を鎮める向きで効くため、効力の測り方がCAR-Tと逆になる。詳しく →） | 約1週間 |
表の下限と日数は、ガイドラインの表1・表2と各報告によります。ガイドラインは試験法を例として示しており、文書自体は申請に拘束力を持ちません（2、5）。
目印や遺伝子を測る方法は数時間から1日で済み、培養や動物への移植は時間がかかる代わりに、細胞が増えるかを直接確かめられます。
軟寒天と動物への移植の限界
軟寒天の方法がiPS細胞を見つけられないのは、iPS細胞が1個ずつにばらされると、自ら死ぬ（アポトーシス細胞が遺伝的プログラムに従って自発的に死に至る過程で、壊死とは異なり膜の完全性が初期段階では保たれる。詳しく →を起こす）性質を持つためです（5.2.1.1）。
動物への移植は腫瘍ができるかを直接見られる方法ですが、割合で表した下限は、表の例ではほかの方法より粗い値です。網膜色素上皮の細胞と一緒に移植するとiPS細胞の腫瘍形成が抑えられたという報告もあり（Kanemura 2013）、結果は一緒に移植する細胞にも左右されます。
ガイドラインは、未分化のiPS細胞の混入を、適切な目印を使って動物を使わない試験（in vitro試験試験管・培養皿などを用いて生体外で行う試験で、細胞や細菌などを使って物質の影響を評価する。詳しく →）で評価することが望ましいとしています。動物での評価は、必須ではないが可能という位置づけです（5.2.1.2）。
感度が高ければ、正しく測れるのか
感度が高いことと、正しく測れることは別です。遺伝子の発現を測る方法は、目印にした遺伝子が、目的の細胞ではほとんど働いていないことを前提にしているためです。
iPS細胞から間葉系幹細胞（骨や軟骨などになる幹細胞）を作った報告では、分化14日目にも、iPS細胞の17.2%にあたるLIN28の発現が残っていました。それでも、培養して増やす方法ではiPS細胞の塊はできませんでした。著者らは、qRT-PCRだけで残ったiPS細胞の有無を決めるのは難しいと述べています（Tano 2014）。
そのため、ガイドラインは、使う目印が妥当かを、対象の細胞ごとに前もって確かめておく必要があるとしています（5.2.1.1）。
このように、どの方法を選ぶかは、求める下限と、結果を待てる日数と、目印が自分の細胞で使えるかの3つで決まります。では、純化をしていれば、この検査は省けるのか。
5. 純化をすれば検査は要らないのか
純化をしても、検査は要ります。純化と検査では、受け持つ役割が違うためです。
- 純化：工程の中で、目的外の細胞と残ったiPS細胞の数を減らします。どれだけ減ったかは、純化をしただけでは分かりません。
- 検査：残ったiPS細胞がどこまで少ないかを、検出の下限つきで示します。検査で細胞を減らすことはできません。
分化のあとで不要な細胞を減らせれば、最終製品に混ざる細胞を管理しやすくなります。ただし純化だけで安全は保証されず、残った未分化細胞の検査は別に要ります。
実際に、2026年に条件と期限を付けて承認されたiPS細胞由来の2品目でも、腫瘍化への対応の1つは製造工程での未分化iPS細胞の規格値です。重い心不全に使う心筋細胞シート表面の温度応答性ポリマーにより、温度を下げるだけで酵素を使わず細胞をシート状のまま剥がして回収できる培養皿です。詳しく →は、未分化iPS細胞が「理論上存在しない」規格値を設けています。パーキンソン病に使うラグネプロセルは、混入率の規格値です（厚生労働省 2026）。
つまり、純化で減らした量と、検査で示せる下限の両方がそろって、はじめて残ったiPS細胞の量を説明できます。では、自分の工程では、何から確かめればよいのか。
6. 自分の工程では何から確かめるのか
まず使える純化の方法を決め、次に未分化の目印と検出法、検出の下限の説明、測る時点の順に決めていきます。
- 使える純化の方法：目的の細胞に、心筋の乳酸のような代謝の違いや、CORINのような表面の目印があるかが出発点です。
- 未分化の目印と検出法：LIN28やTRA-1-60のような目印が、自分の目的の細胞と分化の途中の細胞で、どれだけ出ているかを先に測ります。求める下限に届く方法を選ぶのは、そのあとです。
- 検出の下限の説明：論文の値は借りず、自分の目的の細胞にiPS細胞を決まった割合で混ぜて下限を確かめます。その下限に1回に投与する細胞の数を掛け、混ざりうる個数に直します。
- 測る時点：純化の前後の中間製品と最終製品のどこで測るかを決めます（ガイドライン 5.2.1）。移植する細胞そのものを測りたいなら、細胞を壊さずに、細胞を育てた液（培養上清）で測る方法も報告されています（Masumoto 2022）。
この4つを決めておくと、残ったiPS細胞をどの工程で減らし、どの方法で、どこまで少ないと確かめたかを、記録に沿って説明できます。
腫瘍のもとには、不死化やがん化に関わる性質を得た形質転換発現プラスミドなどの外来DNAを細菌に導入する操作。細胞もあり、ガイドラインでは別の試験で調べる対象です（5.2.2）。ゲノムの変化と核型の調べ方はiPS細胞の核型解析とゲノム安定性、出発材料の細胞を保管するセルバンク目的物質を作る細胞をあらかじめ大量に凍結保存し、製造のたびに同じ素性の細胞を使えるようにした細胞の在庫（MCB/WCB）のことです。詳しく →はセルバンクとはで説明しています。
品質試験の全体は細胞治療の品質管理（CQA）にまとめ、検出の方法と受託先は残存未分化iPS細胞検出で比べられます。
参考文献
- 厚生労働省医薬・生活衛生局医療機器審査管理課長通知 薬生機審発0627第1号（令和元年6月27日）, ヒト細胞加工製品の未分化多能性幹細胞・形質転換細胞検出試験、造腫瘍性試験及び遺伝的安定性評価に関するガイドラインについて（別添の留意点。2 本文書の位置づけ、5、5.2、5.2.1、5.2.1.1、5.2.1.2、5.2.2、表1・表2）
- 厚生労働省医薬局医療機器審査管理課, 再生医療等製品3品目の条件及び期限付承認について（中医協 総-11-2、2026年4月8日。ヒト（同種）iPS細胞由来心筋細胞シートは「製造工程において未分化iPS細胞が理論上存在しない規格値を設定」、ラグネプロセルは「製造工程において未分化iPS細胞の混入率の規格値を設定」）
- Tohyama S, Hattori F, Sano M, et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 2013;12(1):127-137. DOI: 10.1016/j.stem.2012.09.013（ブドウ糖を抜き乳酸を加えた培地で心筋だけが生き残ること。純度は最大99%、移植後に腫瘍をつくらなかったこと）
- Doi D, Samata B, Katsukawa M, et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2014;2(3):337-350.（分化12日目のCORINによる選別で、LMX1A・FOXA2陽性の前駆細胞が47%から76%に上がったこと）
- Sawamoto N, Doi D, Nakanishi E, et al. Phase I/II trial of iPS-cell-derived dopaminergic cells for Parkinson's disease. Nature. 2025;641:971-977.（分化11〜13日目にCORIN陽性の細胞をセルソーターで選んで移植したこと）
- Tateno H, Onuma Y, Ito Y, et al. Elimination of tumorigenic human pluripotent stem cells by a recombinant lectin-toxin fusion protein. Stem Cell Reports. 2015;4(5):811-820.（多能性幹細胞に結合するレクチンと毒素の融合タンパク質を培地に加え、多能性幹細胞を除いたこと）
- Kanemura H, Go MJ, Shikamura M, et al. Tumorigenicity studies of induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived retinal pigment epithelium (RPE) for the treatment of age-related macular degeneration. PLoS One. 2014;9(1):e85336.（NOGマウスの皮下にゲルとともに移植した未分化iPS細胞の50%腫瘍形成量が10の2.12乗個）
- Kanemura H, Go MJ, Nishishita N, et al. Pigment epithelium-derived factor secreted from retinal pigment epithelium facilitates apoptotic cell death of iPSC. Sci Rep. 2013;3:2334.（網膜色素上皮の細胞のシートと一緒に移植すると、iPS細胞の腫瘍形成が抑えられたこと）
- Kuroda T, Yasuda S, Kusakawa S, et al. Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells. PLoS One. 2012;7(5):e37342.（網膜色素上皮の細胞に混ぜたiPS細胞を、TRA-1-60のフローサイトメトリーで0.1%、LIN28のqRT-PCRで0.002%まで検出。軟寒天コロニー形成試験では検出できなかったこと）
- Kuroda T, Yasuda S, Matsuyama S, et al. Highly sensitive droplet digital PCR method for detection of residual undifferentiated cells in cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Regen Ther. 2015;2:17-23.（心筋細胞に混ぜたiPS細胞を、LIN28のデジタルPCRで0.001%まで検出。心不全の患者1人に少なくとも10⁹個の心筋細胞が要るという見積もり）
- Tano K, Yasuda S, Kuroda T, et al. A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system. PLoS One. 2014;9(10):e110496.（ラミニン521と未分化維持iPS細胞を多能性マーカーの発現を保ったまま、ゲノムを安定に保って増やす培養工程。後工程すべての土台。培地での培養で、間葉系幹細胞に混ぜたiPS細胞を0.001〜0.01%まで検出。間葉系幹細胞への分化14日目にLIN28の発現が17.2%残っていたこと）
- Masumoto K, Aihara Y, Miyagawa Kuroishi M, et al. Highly sensitive and non-disruptive detection of residual undifferentiated cells by measuring miRNAs in culture supernatant. Sci Rep. 2022;12:10351.（培養上清のmiR-302bを測り、細胞内のLIN28より高い感度で残ったiPS細胞を検出したこと）
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