iPS細胞はどう増やし、どう保管するのか？継代・凍結・細胞バンクの基本

iPS細胞は、増えた細胞をはがして分け、新しい容器に植え直す継代を繰り返して増やし、増やした細胞を凍らせて保管します。製造に使う細胞は、マスターセルバンクとワーキングセルバンク製造の起点となる細胞を段階的に均質に凍結保存した在庫（マスター/ワーキングセルバンク）。詳しく →の2段に分けて凍らせておくのが一般的で、製造のたびに1本ずつ融かして使います。

ただし、細胞のはがし方と凍らせ方によって、植え直したあとに生き残る細胞の割合や、増え方のそろい方が変わります。継代増殖した細胞を定期的に希釈・移植して培養を維持する操作で、回数が増えると細胞の性質が変化するリスクがある。詳しく →を重ねるほど培養の中で性質が変わるおそれも増えるため、どの継代の細胞をバンクにするかも先に決めておきます。

この記事では、継代のしかた、凍らせ方と融かし方、細胞バンクを2段に分ける理由、バンクで確かめる項目を順に説明します。

1. iPS細胞の拡大培養と細胞バンクとは何か

拡大培養とは、未分化のままのiPS細胞体細胞を初期化して作る多能性幹細胞。同一株から繰り返し分化・製造でき均質性を高めやすい。詳しく →を継代で増やし、製造に要る数までそろえる工程のことです。 細胞バンクは、増やした細胞を同じ時点でまとめて凍らせ、多数の容器に分けて保管したものを指します。

iPS細胞（人工多能性幹細胞さまざまな細胞へ分化できる能力を持つ幹細胞。オルガノイドなどの出発材料になる。詳しく →）は、体の細胞を初期化して、まだ特定の細胞になっていない未分化の状態に戻した細胞です。未分化を保ったまま増やせるため、必要な数まで増やしてから、移植に使う細胞へ分化誘導幹細胞を、発生過程を模した因子の切り替えによって神経・心筋など目的の細胞へ段階的に方向づける操作。詳しく →します（iPS細胞とは）。

分化誘導までの流れは、次の4つの段に分かれます。

1. 解凍する⁠：凍らせておいた株（iPS細胞を作ったときに選んだ1つの系統）の容器を融かし、培養を始めます。
2. 継代で増やす⁠：増えた細胞をはがして分け、新しい容器に植え直すことを数回繰り返します。
3. 凍らせて2段のバンクにする⁠：増やした細胞を多数の容器に分けて凍らせ、マスターセルバンク（MCB）にします。その1本から増やした細胞で、ワーキングセルバンク（WCB）MCBを解凍・拡大して作る、日常製造で取り崩す細胞在庫。製造のたびにここから始めます。を作ります。
4. 製造ごとにWCB目的物質を作る細胞をあらかじめ大量に凍結保存し、製造のたびに同じ素性の細胞を使えるようにした細胞の在庫（MCB/WCB）のことです。詳しく →の1本を解凍する⁠：製造のたびにWCBから1本を融かし、増やしてから分化誘導へ進めます。

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このように、どの段にも確かめることがあります。まずは継代から見ていきます。

2. 継代では何をするのか

継代とは、増えて容器の底を埋めた細胞をはがし、分けて新しい容器に植え直すことです。 iPS細胞は、容器の底に塗った足場（細胞が付着するタンパク質）に貼り付いて増えます（足場と培地で未分化を保つ仕組み）。

継代を繰り返す理由は2つあります。

• 数を増やすため⁠：細胞を何分の1かに分けて植えるたびに、容器の数と細胞の総数が増えていきます。
• よく増える状態を保つため⁠：密になりすぎた培養は、植え直したあとの生存が落ちます。そのため報告された手順では、底の8割ほどが埋まった時点で継代しています（Beers 2012、Nakagawa 2014）。

継代の回数は継代数細胞を植え継いだ回数。培養履歴を表し、産生量や品質の再現性に影響する。詳しく →と呼ばれます。iPS細胞から作る製品について厚生労働省が示した指針（薬食発0907第4号・第5号、2012年）は、株の品質の基準を決め、その品質を保ったまま増やせる継代数を示すよう求めています（第2章第1の3）。

つまり継代は、数を増やすと同時に、細胞が培養を経た長さを積み上げる操作です。では、はがし方を変えると何が変わるのでしょうか。

3. 塊で分けるのと1個ずつにばらすのは、何が違うのか

2つの方法の違いは、植え直したあとに生き残る細胞の割合と、植える細胞の数のそろえやすさにあります。

ヒトのiPS細胞やES細胞（受精卵から作る、iPS細胞と性質の近い幹細胞）は、1個ずつにばらすと多くが死んでしまいます。細胞どうしの接着が失われると、細胞骨格のアクチンとミオシンが強く収縮するためです（Beers 2012）。

この収縮を抑えるのが、ROCK阻害剤トランスポーターの働きをふさぐ薬。他の基質薬の輸送を妨げ、短期間で濃度を変える。詳しく →（収縮の指令を伝えるRho結合キナーゼという酵素を止める薬剤）です。ヒトES細胞の報告では、これを加えると、ばらした1個の細胞が集団を作る割合が約1%から約27%に上がりました⁠（Watanabe 2007）。

ただし、ばらしたあとの生存が低い条件では染色体の異常が出やすいとされるため、ゲノムの見張りと組み合わせて選びます（核型解析とゲノム安定性）。では、何日ごとに何倍に分ければよいのでしょうか。

4. 何日ごとに、何倍に分けるのか

何日ごとに何倍に分けるかは、細胞が増える速さから考え、次の継代までに底の8割ほどが埋まるように決めます。 増える速さは、細胞の数が2倍になるまでの時間（倍加時間）で表します。

• 1個ずつにばらす方法⁠：ラミニン支持細胞（フィーダー）を使わずに幹細胞を培養するため、培養皿表面をラミニンやビトロネクチンなどの接着タンパクでコーティングする基材です。詳しく →511 E8断片（足場に使うタンパク質の一部）と、動物由来の成分を含まない培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。詳しく →では、倍加時間が平均約28時間でした。8〜10日で平均132倍に増えるため、約100分の1に分けて植えることができました（Nakagawa 2014）。
• 塊で分ける方法⁠：EDTAで小さな塊にする手順では、植えてから3〜5日ほどで底の8割が埋まり、次の継代に進みます（Beers 2012）。

どちらも特定の株と条件での値で、株や培地が変われば倍加時間も変わります。自分の株で増え方を測り、倍率と間隔を決め直します。

また、早い継代のうちに多くの容器へ凍らせておけば、継代数の少ない細胞を長く使えます（Nakagawa 2014）。京都大学iPS細胞研究所が臨床用に作ったiPS細胞ストックの報告では、選んだ株を7継代目で約70本の容器に分けて凍らせていました（Umekage 2019）。

では、増やした細胞はどう凍らせるのでしょうか。

5. iPS細胞はどう凍らせ、どう融かすのか

凍結保存でまず避けたいのは細胞の中に氷の結晶ができることで、方法には緩慢凍結毎分1℃前後でゆっくり降温し、氷晶損傷と浸透圧ストレスの両方を抑える凍結法。詳しく →とガラス化の2つがあります。 氷の結晶は細胞の膜を傷つけるため、凍らせる液には、細胞に入り込んで氷をできにくくする凍結保護剤凍結や融解のときの細胞損傷を抑えるために、凍結保存液へ加える保護用の薬剤。詳しく →のDMSO水に溶けにくい薬物やリンカーを溶かし込み、抗体との結合反応を進めるために少量加える有機溶媒です。詳しく →（ジメチルスルホキシド）を加えます。

• 緩慢凍結⁠：DMSOを10%ほど含む液に細胞を入れ、1分あたり約1℃で冷やしてから、液体窒素のタンクなどの超低温へ移します。冷やす速さは、細胞内の氷と脱水の両方を避けるように選びます。
• ガラス化⁠：濃い凍結保護剤を含むごく少量の液を液体窒素に直接浸し、氷にせずガラスのように固めます。結晶はできませんが、扱える液量が少なく、濃い凍結保護剤の毒性と手間が課題です。

ICH Q5D生物薬品の製造に使う細胞基材の樹立と特性解析について定めた国際調和ガイドライン。詳しく →（バイオ医薬品抗体・タンパク質・核酸など生体由来の分子を利用して製造された医薬品の総称。詳しく →の製造に使う細胞の指針）も細胞バンクの例として、凍結保護剤を含む液を密閉容器に入れて制御した条件で凍らせ、液体窒素の気相か液相などで保管する方法を挙げています（2.2.2）。

融かしたあとの生存は、凍らせる前と融かした直後の扱いでも変わります。 ヒトES細胞の報告では、塊のまま緩慢凍結すると生存が低くなりやすく、1個ずつにばらして凍らせ、融かしたあと1日だけROCK阻害剤を加えると、生き残る細胞が増えました（Li 2009）。

条件が合っていれば、融かして4〜7日ほどで次の作業に使えますが、合っていないと2〜3週間かかることがあります（Uhrig 2022）。厚生労働省の指針も、凍結と解凍が株の安定性や規格に影響しないかを確かめるよう求めています（第2章第1の4）。

では、凍らせた細胞を、なぜ2段に分けて持つのでしょうか。

6. なぜマスターセルバンクとワーキングセルバンクの2段に分けるのか

2段に分けるのは、大元の在庫を温存しながら、どの製造ロットも同じ出発点の細胞から作り続けるためです。

MCBは、選んだ株を決めた条件で増やし、1つにまとめた細胞を多数の容器に分けて凍らせたものです。WCBは、MCBの容器を融かして増やした細胞を、再び多数の容器に分けて凍らせたものを指します（ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。詳しく → Q5D 用語集）。

• MCBを開ける回数を減らすため⁠：製造ではWCBを使い、WCBが減ったときだけMCBの次の1本から作り足します。
• 製造に入る細胞の履歴をそろえるため⁠：どのロットもWCBの1本から始まるため、MCBを融かしてから経た継代の回数を、ロットの間でそろえやすくなります。

ICH Q5Dはタンパク質などを作る細胞の指針で、この形を、細胞を供給し続ける、一般に受け入れられた最も実際的な方法としています。年に使う本数が少なければ、MCBだけの1段も原則として使えると認めています（2.2.1）。厚生労働省の指針も、バンクを作る場合はその理由、作り方、特性解析規格試験より高い分解能で製品の品質特性を詳しく調べること。比較可能性の評価などで用いる。詳しく →、保存と更新の方法を明らかにして妥当性を示し、ICH Q5Dの国内通知などを参考にするよう求めています（第2章第2の2(7)）。

iPS細胞でも、GMP（医薬品の製造管理と品質管理原料・資材・中間体・製品を規格に照らして試験し、使ってよいか、出荷してよいかの合否を決める仕事です。GMPでは製造部門から独立させます。詳しく →の基準）に沿ってMCBを作った米国の報告が、MCBを約100本の容器に分け、そこからWCBを作って使う形を示しています（Baghbaderani 2015）。

では、バンクを作ったときには、何を確かめておくのでしょうか。

7. 細胞バンクでは何を確かめるのか

細胞バンクでは、混入していないか、取り違えていないか、iPS細胞としての性質が保たれているか、融かしたあとに増えるかの4つを確かめます。

• 混入⁠：細菌と真菌の無菌試験、マイコプラズマ（細胞壁を持たない小さな細菌）がいないことを確かめる試験、ウイルスの試験を行います。ICH Q5Dは、無菌試験を容器の1%（2本以上）で、マイコプラズマ試験見た目に異常がなくても細胞に影響する微生物マイコプラズマの汚染を確認する試験。詳しく →とあわせてMCBとWCBの両方で行うよう求めています（2.3.2.1）。
• 同一性出荷ロットが意図した細胞集団であることを、表現型マーカーや追跡記録によって確認する品質項目。詳しく →⁠：STR解析（短い配列の繰り返し回数で個人を見分ける方法）とHLA細胞表面にあり自己と非自己を見分けるヒトの主要な組織適合抗原。他家では不一致が拒絶の原因になる。詳しく →型（免疫が自分と他人を見分ける目印の型）で、ドナーと一致するかを確かめます。
• iPS細胞としての性質⁠：未分化の目印を持つ細胞の割合をフローサイトメトリー細胞を一つずつ測定し、表面マーカーや性質を調べる手法です。細胞の種類・純度・活性の確認に使います。詳しく →（細胞を1個ずつ流して蛍光を数える方法）で測り、染色体の数と形をGバンド細胞の染色体をGバンド染色などで並べて数や構造の異常を調べる装置です。細胞製品の遺伝的な安定性の確認に使います。詳しく →核型分析（染色体を染め分けて顕微鏡で見る方法）で調べます。初期化に使ったベクター（遺伝子を運ぶDNA）の残りは、PCR（狙ったDNAを増やして検出する方法）で見ます。
• 融かしたあとの生存と増殖⁠：融かした直後の生細胞の数と割合、数回継代したときの倍加時間を測ります。

先の京都大学iPS細胞研究所のストックでは、混入と同一性を出荷に必須の試験としていました。多能性の目印、ゲノム、核型、残ったベクター、融かしたあとの増え方は、基準を1つに決めにくいものの、異常があれば出荷に響く参考試験です（Umekage 2019）。

試験法はマイコプラズマ試験、記録と保管はセルバンクとはで説明しています。

8. 自分の工程では何から決めるのか

自分の工程では、増やし方、凍らせ方、バンクの形、確かめる項目の順に決めていきます。

1. はがし方と継代の間隔⁠：塊か1個ずつか、ROCK阻害剤（細胞の収縮を抑えて生存を助ける薬剤）を使うかを決め、自分の株の倍加時間から、何日ごとに何倍に分けるかを決めます。
2. 継代数の上限⁠：マスターセルバンク（MCB）選定したドナー細胞を増やし均一化してまとめて凍結した、起点となる細胞在庫。製造の素性を固定します。にする継代と、製造で使える継代の上限を決めます。
3. 凍らせ方と融かし方⁠：凍結保護剤DMSO（ジメチルスルホキシド）の濃度、冷やす速さ、1本の細胞数を決め、融かしたあと使えるまでの日数を確かめます。
4. バンクの本数と保管場所⁠：MCBとワーキングセルバンク（WCB）の本数を、年に使う本数から決めます。火災や停電に備えて、保管場所を分けるかも決めます。
5. 確かめる項目と区分⁠：混入、STR撹拌翼で機械的に混ぜ、スパージャーで通気する最も標準的なバイオリアクターの型式。詳しく →解析（繰り返し配列による個人の識別）とHLA型（免疫の目印の型）による同一性、多能性と核型、融かしたあとの生存のうち、どれを出荷に必須とするかを決めます。

上の段を変えれば、下の段の数字も測り直します。このあと細胞を目的の細胞に変える工程はiPS細胞の分化誘導で、増やす間は未分化を保つのに最後に残ると困る理由は残った未分化細胞はなぜ問題かで説明しています。

参考文献

• 厚生労働省医薬食品局長, ヒト（同種）iPS（様）細胞加工医薬品等の品質及び安全性の確保について（薬食発0907第5号、2012年9月7日）。改正後の全文は、医薬発0117第11号（2025年1月17日）の別紙（第2章第1の3 株の重要細胞特性指標と、品質を保ったまま増やせる継代数。第2章第1の4 凍結保管と解凍の影響の確認。第2章第2の2(7) 細胞のバンク化と、医薬審第873号を参考にすること）
• 厚生労働省医薬食品局長, ヒト（自己）iPS（様）細胞加工医薬品等の品質及び安全性の確保について（薬食発0907第4号、2012年9月7日）。改正後の全文は、医薬発0117第8号（2025年1月17日）の別紙（細胞のバンク化について同種の指針と同じ項目）
• ICH Q5D, Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products（2.2.1 2段のバンク、2.2.2 バンクの作り方と保管、災害への備え、2.3.2.1 無菌試験とマイコプラズマ細胞培養に混入しうる微小な細菌。セルバンクなどで否定試験が求められる。詳しく →試験、2.3.3 継代の少ない細胞と製造に使う上限の細胞での安定性の確認、用語集のMCBとWCB。国内では医薬審第873号、2000年7月14日）
• Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2007;25(6):681-686.（1個ずつにばらしたヒトES細胞がY-27632で細胞死を免れ、集団を作る割合が約1%から約27%に上がったこと）
• Beers J, Gulbranson DR, George N, et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 2012;7(11):2029-2040.（EDTAで小さな塊にする継代。ばらした細胞の死はアクチンとミオシンの収縮によること、塊では薬剤なしで生き残ること、植えてから3〜5日ほどで8割が埋まったら継代すること、密になりすぎると生存が落ちること、ばらしたあとの生存が低いと核型の異常が出やすいとの指摘、DMSOを10%含む液での凍結）
• Nakagawa M, Taniguchi Y, Senda S, et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 2014;4:3594.（ラミニン511 E8断片と動物由来成分を含まない培地。1個ずつにばらして数を数えて植え、植えるときだけY-27632。8〜10日で8〜9割が埋まり、平均132倍、倍加時間は平均28.34時間、約100分の1に分けて植えられたこと。緩慢凍結での保存。早い継代でまとめて臨床用のストックを作れること）
• Li X, Krawetz R, Liu S, Meng G, Rancourt DE. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 2009;24(3):580-589.（塊のままの緩慢凍結では融かしたあとの生存が低くなりやすいこと。1個ずつにばらして凍らせ、融かしたあと1日Y-27632を加えると生存が増えたこと）
• Uhrig M, Ezquer F, Ezquer M. Improving Cell Recovery: Freezing and Thawing Optimization of Induced Pluripotent Stem Cells. Cells. 2022;11(5):799.（氷の結晶と凍結保護剤、1分あたり約1℃の緩慢凍結、ガラス化の冷却速度と課題、塊と1個ずつの凍結の利点と欠点、融かしたあとのROCK阻害剤、条件が合えば4〜7日、合わなければ2〜3週間で使える状態に戻ること）
• Umekage M, Sato Y, Takasu N. Overview: an iPS cell stock at CiRA. Inflamm Regen. 2019;39:17.（選んだ株を7継代目で約70本の容器に分けて凍らせる2次ストック。出荷に必須の試験と参考試験の区分、試験項目と方法）
• Baghbaderani BA, Tian X, Neo BH, et al. cGMP-Manufactured Human Induced Pluripotent Stem Cells Are Available for Pre-clinical and Clinical Applications. Stem Cell Reports. 2015;5(4):647-659.（GMP医薬品を一定の品質で安全に造るために守るべき製造・品質管理の基準（適正製造規範）です。詳しく →に沿ったiPS細胞のMCB。約100本の容器、液体窒素の気相での保管、MCBからWCBを作る形、出荷時の試験項目）