iPS細胞の未分化維持とは？増やす間、なぜ「何にもなっていない状態」を保つのか

iPS細胞体細胞を初期化して作る多能性幹細胞。同一株から繰り返し分化・製造でき均質性を高めやすい。詳しく →の未分化維持iPS細胞を多能性マーカーの発現を保ったまま、ゲノムを安定に保って増やす培養工程。後工程すべての土台。詳しく →とは、iPS細胞を増やす間、まだ特定の細胞になっていない状態（未分化）を保つことです。移植に使う細胞は増やしたiPS細胞を分化させて作るため、増やす段の状態が、そのあとの工程の出発点を決めます。

ただし、iPS細胞は、放っておけば未分化のままでいる細胞ではありません。培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。詳しく →の成分や細胞の密度がずれると、一部の細胞が自然に分化を始めます。

この記事では、未分化とは何か、崩れると何が起きるのか、なぜ崩れるのか、現場で毎日何を見ているのか、品質としてどう確かめて記録するのかを順に説明します。

1. iPS細胞の「未分化」とは何か

未分化とは、iPS細胞がまだ心筋や神経などの特定の細胞になっていない状態のことです。

iPS細胞はこの状態の間、体を作る3つの層（内胚葉・中胚葉・外胚葉をまとめて三胚葉発生初期に分かれる外胚葉・中胚葉・内胚葉の三つの層。分化誘導ではまずこのいずれかへ細胞を方向づける。と呼ぶ）のどの細胞にもなれる性質を保っており、この性質を多能性と呼びます。皮膚や血液の細胞がすでに決まった役割を持っているのと違い、未分化のiPS細胞は、まだ役割が決まっていません。そのうえで、分裂して同じ性質の細胞を増やし続けられます（自己複製）。

培養皿の中のiPS細胞は、細胞が集まったコロニーという塊を作って増えます。未分化を保ったコロニーでは、核の大きい丸い細胞がすき間なく詰まり、ふちの境目がはっきりしています（Kato 2016）。

未分化が崩れ始めると、コロニーの境目がぼやけ、核に比べて細胞質細胞内部の区画。大腸菌では還元的で、そのままではジスルフィド結合ができにくい。詳しく →（核の外側の部分）の広い平たい細胞が現れます（Kato 2016）。こうした分化した部分は、コロニーのふちにも中心にも出てきます（CiRA 2014）。

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このように、未分化かどうかは、まずコロニーの形に表れます。では、増やす間にこの状態を保つことは、なぜそれほど大切なのでしょうか。

2. なぜ増やす間、未分化を保つ必要があるのか

増やす間に未分化が崩れると、そのあとの分化誘導幹細胞を、発生過程を模した因子の切り替えによって神経・心筋など目的の細胞へ段階的に方向づける操作。詳しく →を、そろった状態の細胞から始められなくなるためです。

分化誘導とは、薬剤を段階ごとに切り替えて、iPS細胞を目的の細胞へ進ませる工程のことです（iPS細胞の分化誘導）。未分化が崩れたときに起きることは、次の3つです。

• 自然に分化した細胞が混ざる⁠：自然な分化は、薬剤で進む方向を決める分化誘導と違い、どの種類の細胞へ進むかが決まっていません。そのため、分化誘導を始める前から目的外の細胞が混ざります。
• 分化誘導の出発点がばらつく⁠：分化誘導の手順は、薬剤を加える時点の細胞の状態を前提に組まれています。細胞が密な状態から心筋への分化を始めた報告では、密な培養で起きる培地の酸性化を抑えると、心筋が多くできました（Liu 2018）。
• 増やしたい未分化の細胞が減る⁠：未分化を保つ条件が不安定だと、分化する細胞が増えるぶん、未分化の細胞が減ります。幹細胞の培養で培地中の増殖因子の量を安定させた報告では、自然な分化が減り、幹細胞の数が増えました（Lotz 2013）。

どれも分化誘導に入る前に起きる変化です。つまり未分化維持は、分化誘導の結果を同じ手順で再現するための前提にあたります。では、未分化はなぜ崩れるのか。

3. 未分化はなぜ崩れるのか

iPS細胞の未分化は、培地と足場（細胞が付着する基材）の条件で保たれているため、その条件がずれると崩れます。

培地から増殖因子のFGF2（線維芽細胞増殖因子2、未分化を保つ信号の1つを細胞に送るタンパク質）を抜いた実験では、iPS細胞は2週間のうちに三胚葉の細胞へ自然に分化しました（Nakagawa 2014、Chen 2012）。

未分化は、培養の条件で毎日保っている状態です。この条件が日々の培養でずれる主な原因は、次の3つです。

• 密になりすぎ・継代増殖した細胞を定期的に希釈・移植して培養を維持する操作で、回数が増えると細胞の性質が変化するリスクがある。詳しく →の遅れ⁠：継代（増えた細胞を分けて新しい皿に植え直すこと）が遅れて細胞が密になると、細胞が出す乳酸で培地が酸性に傾きます。高い密度の培養では培地のpHが6.3まで下がり、分裂する細胞が減って、死ぬ細胞が増えました（Liu 2018）。
• 培地交換の間隔⁠：FGF2は、培養している間に速く減ります。ヒトの多能性幹細胞さまざまな細胞へ分化できる能力を持つ幹細胞。オルガノイドなどの出発材料になる。詳しく →の培養で測った報告では、交換から4時間で半分以下になり、24時間後にはほとんど残っていませんでした（Lotz 2013）。
• 足場や播いた細胞のむら⁠：皿の中で足場のタンパク質や細胞が均一に広がっていないと、同じ皿の中に密な所とまばらな所ができます。研究機関の手順書作業の手順を定めた文書。品質システムの要素を具体化し、査察でも運用が確認される。詳しく →は、足場のタンパク質を加えたらすぐ混ぜ、細胞を播いたらすぐ皿を揺らして広げるよう指示しています（CiRA 2014）。

一方で、密度は低すぎても未分化を保ちにくくなります。ES細胞（初期の胚から作る、iPS細胞とよく似た多能性幹細胞）の報告では、小さなコロニーほど早く分化し、分化した細胞は周りの細胞の分化を促すタンパク質を出していました（Peerani 2007、Takahashi 2007）。

このように、未分化の崩れは、密度・時間・皿の中の場所のずれから起こります。足場と培地の働きは、足場と培地で未分化を保つ仕組みで説明します。

4. 現場では毎日、何を見ているのか

現場では、培地を換えるたびにコロニーの形と密度を顕微鏡で見て写真を残し、分化した部分があれば取り除きます。

研究機関の手順書も、培地を換えるたびに位相差顕微鏡で観察し、写真を撮るよう定めています（CiRA 2014）。位相差顕微鏡は、染色しないまま透明な細胞の輪郭を見られるため、細胞を傷つけずに毎日観察できます。

• コロニーの形⁠：ふちが滑らかか、細胞がすき間なく詰まっているか、平たい細胞が出ていないかを見ます。
• 密度⁠：細胞が皿の何割を覆ったか（コンフルエンシー培養容器の底面積に対して細胞が覆っている面積の割合を示す指標で、細胞の増殖状態や感染実験の条件を管理するために用いる。）を見て、継代の時期を決めます。先の手順書では8割ほど覆った細胞を継代し、培地の色が1日でオレンジから黄色に変わるようになったら、交換を毎日にします（CiRA 2014）。
• 分化した部分の除去⁠：平たい細胞が広がった部分やコロニーは取り除き、コロニーを拾って増やすときも、分化した部分を除いてから拾います（CiRA 2014、Kato 2016）。

継代の間隔と培地交換の頻度は培地と足場の組み合わせで変わり、8日前後で継代する手順書もあれば、培地を毎日換えて3〜5日で継代する方式もあります（CiRA 2014、Beers 2012）。詳細はiPS細胞の増やし方・凍結・細胞バンクで扱います。

形の判断は人の目に頼るため、数値になりにくいことが課題です。画像から形を数値にしてコロニーを分類した報告では、分化した部分のあるコロニーを見分けられ、遺伝子の発現目的タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で転写・翻訳させ、機能的なタンパク質として産生させる工程。詳しく →による分類ともよく一致しました（Kato 2016）。

ただし、形だけでは、未分化の細胞が全体の何割かまでは数えられません。そこで節目には、未分化の目印を測ります。

5. 未分化かどうかは、何で確かめるのか

未分化かどうかは、未分化の細胞が作る特有の分子を持つ細胞の割合で確かめます。

この目印となる分子を未分化マーカーと呼び、分化が進むと減っていきます。目印は、細胞のどこにあるかで2つに分かれます。

• 細胞の中の目印⁠：核の中で遺伝子の読み出しを調節するタンパク質を転写因子と呼び、OCT4（オクト4）とNANOGiPS細胞が未分化・多能性を保っていることを示す指標分子。OCT4・SOX2・NANOGなどの発現で確認する。（ナノグ）が使われます。どちらも未分化の細胞で強く働く遺伝子から作られます（ISCI 2007）。
• 細胞の表面の目印⁠：細胞膜の糖脂質（糖が結合した脂質）にある目印（SSEA-4）と、糖鎖タンパク質に付加される糖の鎖状構造で、抗体の有効性・免疫原性などに影響する重要な品質特性。詳しく →（糖がつながった鎖）にある目印（TRA-1-60）が使われます。

測るときは、蛍光の目印を付けた抗体で細胞を染め、細胞を1個ずつ流して光る細胞を数えるフローサイトメトリー細胞を一つずつ測定し、表面マーカーや性質を調べる手法です。細胞の種類・純度・活性の確認に使います。詳しく →を使います。ISSCR（国際幹細胞学会）の基準も、細胞の集団のむらを、細胞1個ずつを測る方法で、複数の時点で調べることを勧めています（2.3.1.a）。

目印によって、分化が始まってから減る速さは違います。国際的な品質評価では、分化を始めた細胞でSSEA-4が長く陽性のまま残り、OCT4iPS細胞が未分化・多能性を保っていることを示す指標分子。OCT4・SOX2・NANOGなどの発現で確認する。やTRA-1-60はより早く減りました（Hägg 2026）。⁠そのため、1つの目印だけでは、分化し始めた細胞まで未分化と数えるおそれがあります。

では、測った陽性率は、品質の記録としてどう残せばよいのか。

6. 品質の記録には、何を残すのか

品質の記録には、どの目印をどの方法で測り、陽性の細胞が何%だったかを、継代の回数と一緒に残します。

同種のiPS細胞を使う製品についての厚生労働省の指針は、細胞の特性を表す指標の例として、形態学的評価、表現型特異的マーカー（細胞の種類に特有の目印）、核型、細胞増殖特性、多分化能などを挙げています。そのうち重要な指標を選んで基準を設け、その基準を保ったまま増やせる継代数細胞を植え継いだ回数。培養履歴を表し、産生量や品質の再現性に影響する。詳しく →を示すことを求めています（第2章第1の3）。

陽性率の目安として、国際的な品質評価の報告は、細胞の中の目印と表面の目印を少なくとも1つずつ組み合わせ、陽性の細胞が70%を超えることが一般に期待されるとしています（Hägg 2026）。規制が定めた値ではないため、基準値は自分の株と測定法での実績から決めます。

同じ数字でも、測り方が違えば比べられません。同じ報告がまとめた2019年の評価では、18の施設が同じ細胞を測り、未分化の試料では結果がおおむねそろった一方、自然に分化させた試料では大きくばらつきました。原因には、試薬や染色の組み合わせ、装置の違いが挙げられています（Hägg 2026）。

そのため記録には、陽性率の数字に加えて、使った抗体と装置、陽性と判定する境の決め方も残します。こうしておけば、ある継代の細胞が前の継代と同じ状態かを、あとから比べられます。

7. 自分の工程では何から確かめるのか

自分の工程では、毎日の観察の決まりから順に、次の4つを決めていきます。

1. 観察と写真の決まり⁠：培地を換えるたびにコロニーの形と密度を見て、写真を残します。分化した部分を取り除く基準は、言葉と写真の例で決めておきます。
2. 継代と培地交換の目安⁠：皿の何割を覆ったら継代するか、培地を何日おきに換えるかを、使う培地と足場の組み合わせで決めます。
3. 未分化の目印と測り方⁠：細胞の中の目印と表面の目印を組み合わせ、抗体、装置、陽性と判定する境まで手順に書きます。
4. 品質を保てる継代数⁠：コロニーの形と目印の陽性率が、何回の継代まで保たれるかを記録し、増やしてよい上限を決めます。長く増やすと起こりうるゲノムの変化は、iPS細胞の核型解析とゲノム安定性で扱います。

上の2つを変えたときは、下の2つの値も確かめ直します。目印を測る装置はフローサイトメトリー、コロニーを撮り続ける装置はライブセルイメージングで比べられます。

こうして増やす間は未分化を保ちますが、分化誘導を終えたあとは逆に、未分化のまま残ったiPS細胞を減らす必要があります。では、なぜ最後に残ると困るのか。その理由は、増やす間は未分化を保つのに、最後に残ると困るのはなぜかで説明します。

参考文献

• 厚生労働省医薬局長通知 医薬発0117第11号（2025年1月）, 「ヒト（同種）iPS（様）細胞加工医薬品等の品質及び安全性の確保について」の一部改正について（別紙は改正後の薬食発0907第5号と、その別添「ヒト（同種）iPS（様）細胞加工医薬品等の品質及び安全性の確保に関する指針」。第2章第1の3 細胞株の樹立（細胞純度・形態学的評価・HLA細胞表面にあり自己と非自己を見分けるヒトの主要な組織適合抗原。他家では不一致が拒絶の原因になる。詳しく →タイピング・表現型分子が標的に結合するかなど、実際に現れる働き・性質のこと。詳しく →特異的マーカー・核型・DNAフィンガープリンティング・細胞増殖特性・多分化能などから重要細胞特性指標を同定して基準を設定し、品質を維持したまま増殖が可能な継代数又は分裂回数を示すこと））
• International Society for Stem Cell Research（ISSCR）, Standards for Human Stem Cell Use in Research, Section 2: Pluripotency and the Undifferentiated State（2023年。2.1.1 多能性は分化させる試験で示す、2.1.1.a 確立した株は少なくとも未分化マーカーの定量で追う、2.2.1 OCT4・NANOGなどは「多能性マーカーiPS細胞が未分化・多能性を保っていることを示す指標分子。OCT4・SOX2・NANOGなどの発現で確認する。」ではなく「未分化状態のマーカー」と呼ぶ、2.3.1.a 集団の不均一さはフローサイトメトリーなど細胞1個ずつの方法で、複数の時点で調べる）
• Ludwig TE, Andrews PW, Barbaric I, et al. ISSCR standards for the use of human stem cells in basic research. Stem Cell Reports. 2023;18(9):1744-1752.（上の基準の要約。マーカーの発現は多能性の証明にならないこと）
• Hägg A, Wood R, Mochizuki AL, et al. Toward standardized iPSC testing: Insights from a multi-year international Quality Assessment Round. Stem Cell Reports. 2026;21(4):102857.（細胞内の目印（OCT3/4・NANOG・SOX2iPS細胞が未分化・多能性を保っていることを示す指標分子。OCT4・SOX2・NANOGなどの発現で確認する。など）と表面の目印を1つ以上ずつ組み合わせ、未分化のiPS細胞では陽性が7割を超えることが一般に期待されること（ISCBI 2015とGAiT 2018を引用）。2019年の評価（18施設・11か国）で、未分化の試料ではおおむねそろい、自然に分化させた試料では大きくばらついたこと、その原因に試薬・染色の組み合わせ・装置の違いを挙げていること。SSEA4は分化の初期にも陽性が残り、SSEA5・TRA-1-60・OCT3/4はより早く減ったこと）
• International Stem Cell Initiative; Adewumi O, Aflatoonian B, Ahrlund-Richter L, et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 2007;25(7):803-816. DOI: 10.1038/nbt1318（17の研究室のES細胞の株が、糖脂質の抗原SSEA3・SSEA4、ケラタン硫酸の抗原TRA-1-60・TRA-1-81、NANOG・POU5F1（OCT4）などを共通して発現していたこと）
• Kato R, Matsumoto M, Sasaki H, et al. Parametric analysis of colony morphology of non-labelled live human pluripotent stem cells for cell quality control. Sci Rep. 2016;6:34009.（未分化の細胞は核の大きい丸い細胞がすき間なく詰まること。分化したコロニーは境目がはっきりせず、細胞質が平たく広がり核の割合が低いこと。部分的に分化したコロニーを手で除いていること。染色しない画像の形の数値で分化した部分のあるコロニーを分類でき、遺伝子発現での分類と同様の結果だったこと）
• Nakagawa M, Taniguchi Y, Senda S, et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 2014;4:3594.（bFGF（FGF2）を抜いた培地で2週間培養すると、iPS細胞が三胚葉の細胞へ自然に分化したこと）
• Chen G, Gulbranson DR, Yu P, Hou Z, Thomson JA. Thermal stability of fibroblast growth factor protein is a determinant factor in regulating self-renewal, differentiation, and reprogramming in human pluripotent stem cells. Stem Cells. 2012;30(4):623-630. DOI: 10.1002/stem.1021（FGF・TGF/Nodal・インスリン/IGFの信号で、ES細胞とiPS細胞が増える未分化の状態に保たれること）
• Lotz S, Goderie S, Tokas N, et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 2013;8(2):e56289.（ES細胞の培養で、交換から4時間でFGF2が半分以下になり、翌日にはほとんど残らなかったこと。FGF2の量を安定させると幹細胞の数が増え、自然な分化が減ったこと）
• Liu W, Ren Z, Lu K, et al. The suppression of medium acidosis improves the maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells at high density in defined cell culture medium. Int J Biol Sci. 2018;14(5):485-496.（高い密度で乳酸により培地のpHが6.3まで下がり、S期の細胞が減って細胞死が増えたこと。炭酸水素ナトリウムで酸性化を抑えると心筋への分化が改善したこと）
• Peerani R, Rao BM, Bauwens C, et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 2007;26(22):4744-4755.（ヒトES細胞で、小さなコロニーほど分化が進み、分化した細胞（胚体外内胚葉）が出すBMP2が周りの細胞の自己複製に拮抗したこと）
• Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131(5):861-872. DOI: 10.1016/j.cell.2007.11.019（ヒトiPS細胞が、形・増殖・表面の抗原・遺伝子発現でヒトES細胞とよく似ていたこと）
• Beers J, Gulbranson DR, George N, et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 2012;7(11):2029-2040.（培地を毎日換え、播いてから通常3〜5日で約8割を覆った時点で継代すること）
• 京都大学iPS細胞研究所（CiRA）, プロトコール フィーダーフリーでのヒトiPS細胞の樹立・維持培養（2014年3月。培地交換のたびに位相差顕微鏡で観察して写真を撮ること、8割ほど覆った細胞を継代し、継代は8日前後を目安とすること、培地交換は継代翌日から1日おきで、培地の色が早くオレンジ〜黄色に変わるようになったら毎日にすること、足場のタンパク質を加えたらすぐ混ぜ、播種後すぐにプレートを揺らして均一に広げること、コロニーのふちや中心が分化している場合は除いてから未分化の部分を拾うこと）