mRNAのキャップ効率は、なぜ測るのに半日かかっていたのか

mRNAのキャップ効率とは、mRNAの5′末端に、細胞に読ませるための目印（キャップ）が付いている分子の割合です。付いていない分子は翻訳されにくく、免疫の反応も招くため、mRNA医薬では重要な品質特性として測ります。

ただし、標準的な測り方は、試料の準備から結果まで4〜6時間かかっていました。2026年にVaccines誌に出た論文は、この全工程を1.5時間未満に縮めたと報告しています。

どこを省いて短くしたのか、省いたぶんを何で埋めたのか、自社の構築物で同じようにできるかを確かめる点を説明します。

1. キャップ効率は、どうやって測っているのか

mRNAの5′末端のキャップを含む短い断片だけを酵素で切り出し、その断片の質量を、液体クロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。詳しく →と質量分析をつないだ装置（LC-MS液体クロマトグラフで成分を分離したうえで質量分析計にかけ、分子量を測って物質の同定や定量を行う手法です。詳しく →）で読んで、キャップの付いた分子の割合を出します。

mRNAは数千塩基の長い分子なので、そのままでは末端の違いを質量では読み分けられません。そこで、切りたい位置に合うDNAのプローブを貼り付け、DNAとRNAが対になった所だけを切るRNase HDNAとRNAが対合した二本鎖のRNA鎖を選択的に切断する細胞内酵素。ギャップマー型ASOの分解作用を担う。詳しく →という酵素で、5′末端の断片を切り出します。

切り出した断片を、この装置で測ると、キャップの付いた断片と付いていない断片が別の質量として出てきます。その面積の比が、キャップ効率です。基本の流れはキャッピング効率の測り方で説明しています。

2. なぜ、全工程で4〜6時間もかかっていたのか

切り出した断片を磁気ビーズで拾う精製と、mRNAの折りたたみを熱でほどいてから冷まして切るという往復に、時間がかかっていたからです。

mRNAは自分で折りたたまれて、切りたい位置がプローブと対になりにくくなります。そのため、いったん高温でほどき、酵素が働く温度まで冷ましてから切る、という手順が要りました。

切ったあとは、ビオチンを付けたプローブごと磁気ビーズで断片を拾い、残りの全長や酵素を落としてから測定にかけます。この操作は装置に入れる余計なものを減らせる一方で、手作業が増え、断片の取りこぼしや、人による差が入り込みます。

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3. 論文は、どこを替えて1.5時間未満にしたのか

熱に強いRNase Hでほどくと切るを一つの工程にまとめ、断片の精製を省いて、そのまま測定にかけました。

熱に強い酵素なら、高温でmRNAがほどけた状態のまま切れるので、冷ます往復が要りません。精製を省けば、ビーズの操作にかかる時間と、取りこぼしの不確かさもなくなります。

ただし、精製を省くと、切り出した断片のほかに、残りの全長、プローブ、酵素、緩衝液溶液のpHを一定範囲に保つために使用される弱酸と共役塩基の混合溶液。詳しく →の塩が混ざったまま装置に入ります。そこで論文は、ガイドになるDNAプローブを設計し直し、狙った位置だけを切る特異性分析法において、共存する不純物・分解物・添加剤などが存在しても目的成分だけを正確に測定できる能力。詳しく →を98%以上にしたうえで、分離の条件にも手を入れました。⁠省いた工程のぶんを、切断の精度と装置側の分離条件で埋めた、という組み立てです。

4. 混ざったままの試料を、装置はどう読み分けるのか

イオンペア試薬オリゴ核酸などの分析で、逆相カラムへの保持を高めて分離を良くするため移動相に加える試薬です。詳しく →を使う分離の条件を詰めて、ピークが複数に割れる原因になる金属イオンの付着を抑えました。

RNAは、リン酸の部分にナトリウムやカリウムのイオンが付きやすく、そのままでは同じ分子が質量の少しずつ違う複数のピークに割れて見えます。ピークが割れると1本あたりの高さが下がり、もともと量の少ない成分は、ほかのピークの裾に埋もれます。

イオンペア試薬は、RNAのリン酸と対になって金属イオンの付着を防ぐ試薬です。ピークが1本にまとまれば、キャップの付いていない少量の成分も読み取りやすくなります。

論文では、キャップのない物質を1%から50%まで5段階で混ぜた試料を測り、ほとんどの水準でばらつきは10%未満でした。外れたのは、混ぜた量がもっとも少ない水準です。

参考文献

• Yang R, Wu X, Zhang X, Fu S, Gu K, Lv Z, Li X, Mao Q. Rapid LC-MS Quantification of mRNA Vaccine Capping Efficiency via High-Specificity RNase H Cleavage and Metal Adduct Suppressed Chromatography. Vaccines (Basel). 2026;14(7):581. DOI: 10.3390/vaccines14070581（切断の特異性98%以上、熱に強いRNase H、精製の省略、全工程4〜6時間から1.5時間未満、イオンペア条件による金属アダクトの抑制）
• Beverly M, Dell A, Parmar P, Houghton L. Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem. 2016;408(18):5021-5030.（ビオチン付きプローブとRNase Hで切り出す標準的な方法）