抗体を付けたLNP（tLNP）は、製造と分析で何が増えるか

標的化LNP（targeted LNP、tLNP）は、LNPの表面に抗体やその断片を付けて、静脈内に投与しても肝臓へ集まりにくくすることを狙い、T細胞や造血幹細胞血液細胞のもとになる幹細胞。採取して体外で遺伝子を編集し、体内に戻す治療に使う。詳しく →のような狙った細胞に核酸を届ける設計です。核心は一点、抗体は「付いているか」ではなく「何本、どの向きで、結合する力を保ったまま付いているか」を測らないと、品質として扱えないことです。粒子径、PDI粒子径分布の広がりを表す指標。DLSで会合や凝集の傾向を早期に捉えるのに使う。詳しく →、封入率は、その手前の必要条件にすぎません。

土台のLNPの作り方はmRNA-LNPの製造工程に、体内でCAR-T患者や健常ドナーのT細胞にCAR（キメラ抗原受容体）を導入し、がん細胞を攻撃させる細胞治療。詳しく →を作る文脈はin vivo CAR-Tの記事に預けます。ここでは、抗体を付けたことで増える工程と分析を、付け方、従来の3項目の限界、抗体の数と向き、遊離抗体の除去、標的細胞での効き目の順に追い、最後に確認の順番をまとめます。

肝臓へ行く理由 ― 抗体で変えたいこと

ふつうのLNPは、静脈内に投与すると肝臓に集まります。血液の中の仕組みが、そこへ運ぶからです。

Alnylam の研究グループは2010年、イオン化脂質を使ったLNPが血中でアポリポタンパク質脂質とタンパク質の複合体。EVと密度やサイズが近く、精製で分離しにくい夾雑物になる。詳しく →E（ApoE）をまとい、肝細胞に取り込まれることを示しました。ApoE を欠くマウスでは遺伝子の抑制活性が落ち、ApoE を補うと回復しています。肝細胞が標的なら、この性質は好都合です。T細胞や造血幹細胞を狙うと、投与した粒子の多くは標的に届かず、必要な用量だけが膨らみます。

そこで粒子の表面に、狙う細胞の受容体に結合する抗体を載せます。動物での例は複数あります。Rurik らは2022年の Science で、CD5 を狙う抗体を載せたLNPに、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）を標的とするCAR特定の抗原を認識するよう設計し、細胞に導入して指向性を与える人工の受容体。詳しく →のmRNAを入れ、心臓の線維化を起こしたマウスのT細胞に届けました。CARを出すT細胞は投与後48時間以内に現れ、数日で消える一過性のものでした。造血幹細胞のCD117（c-Kit）を狙うLNPは、Breda らが2023年の Science で報告しました。MIT の Shi らは同年の Nano Letters で、Cre mRNA を1 mg/kg 投与し、造血幹細胞と前駆細胞のおよそ90%を編集したとしています。いずれも動物の結果です。

臨床に入った例もあります。Capstan Therapeutics は2025年6月、CD8を発現するT細胞を狙って抗CD19 CARのmRNAを届ける CPTX2309 の第1相試験で、最初の参加者への投与を発表しました。対象は健康な人で、見るのは安全性、薬物動態投与した薬が体内で吸収・分布・代謝・排泄されていく挙動。ADCではDARが大きく影響する。詳しく →、B細胞の減少と回復です。患者での有効性は、この試験の先にあります。

LNPを肝臓から引き離す手段は、粒子の外側に抗体という別の原料と別の工程を足すことでした。品質管理遺伝子治療製品の品質・安全性・有効性を保証するために製造・出荷の各段階で実施する試験・管理の総体。詳しく →の項目が増えるのは、そこからです。

抗体の付け方 ― ポストインサーション、ワンポット、クリック

抗体の付け方は、いつ付けるかと、何で結ぶかの組み合わせで決まります。

「いつ」は2通りです。ポストインサーション（post-insertion）は、抗体を結んだPEG脂質をミセルにしておき、できあがったLNPに差し込みます。ワンポット（one-pot）は、反応基を持つPEG脂質を処方に混ぜてLNPを作り、そこへ抗体を結びます。T細胞を狙った例を整理したレビューは、CD4とCD5をDSPE-PEG-マレイミドチオール基と選択的に結合する反応基。システイン結合型ADCで薬物リンカー側に用いられる。詳しく →によるポストインサーション、CD3をワンポットの例に挙げています。

「何で」の代表が、マレイミドとクリックです。マレイミドは抗体のチオール基（-SH）と反応します。Capstan Therapeutics の特許明細書には、チオールを出す経路として、SATAという試薬による導入と、TCEPによるジスルフィド結合システイン残基どうしが作るS-S結合。タンパク質の立体構造を留める橋になる。詳しく →の部分還元が書かれ、前者はゲルろ過、後者はTFFで精製しています（US 12311033）。クリックは、アジドを導入した抗体を、DBCO銅を使わずにアジドと環状アルキンが選択的に結合するクリック反応用の試薬で、タンパク質を穏やかに修飾できます。詳しく →を付けた脂質に銅触媒なしで結ぶ方法です。Waters の2026年のポスターは、DBCO脂質の割合を0、1、2.5、5%と振ったtLNPを調べました。

反応基付きのPEG脂質LNP表面を覆い、安定性や体内動態を調整する脂質。詳しく →は、LNP用脂質の供給元から買います。Avanti（2020年に Croda が買収）は DSPE-PEG(2000) Maleimide（880126）と DSPE-PEG(2000) DBCO（880229）を、日油は SUNBRIGHT ブランドのPEG脂質を、Merck は各種脂質の製品群と製造を、Corden Pharma は脂質のGMP受託製造製造をCDMOやCMOなど外部の製造所へ委託すること。委託しても品質への最終的な責任は委託者に残る。詳しく →を出しています。反応基付きの品を医薬品の原料として、どのグレードで買えるかは、供給元ごとに確かめる点です。土台のLNPを混ぜる装置は、従来のLNPと同じ考え方で選べます。Cytiva の NanoAssemblr や KNAUER の衝突噴流ミキサーが一例です。

マレイミドには弱点があります。水の中で加水分解して、チオールと反応できなくなるのです。リポソームで測った研究（Oswald ら、2016年）では、マレイミド脂質を膜の形成前から入れると、表面で活性を保っていたのは63%で、精製を経ると32%まで下がりました。形成後に差し込むと、76%が活性を保っています。結べたあとも、チオエーテル結合が逆反応で外れる経路は、マレイミドを使うADC標的を選ぶ抗体に、細胞傷害性の薬物（ペイロード）をリンカーでつないだ分子。詳しく →の研究でよく知られています。リポソームの数字をLNPにそのまま当てはめることはできませんが、反応基の何%が生きているかが抗体の本数のばらつきに直結する構造は変わりません。

向きも分かれ目です。NHSエステルでリシンにランダムに結ぶと、抗体の向きがばらばらになって活性が落ちると、Monash大学のプレプリントは述べています。総説は、部位特異的なクリックやFc領域の糖鎖を使う方法を挙げています。Monash大学のグループは2025年の Nature Nanotechnology で、LNP表面に抗Fcナノボディラクダ科の重鎖抗体に由来し、単一ドメインで抗原を認識する小さなフラグメント。対合ミスが起きず安定。詳しく →を載せ、化学修飾核酸の糖・骨格・末端に施し、安定性・結合力・免疫原性を整える改変。詳しく →していない抗体を捕まえて向きをそろえる方式を報告しました。タンパク質の発現目的タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で転写・翻訳させ、機能的なタンパク質として産生させる工程。詳しく →は、抗体のないLNPの1,000倍以上、従来の抗体修飾の8倍以上です（マウス）。非共有結合で捕まえる分、血中で抗体が離れないかは確かめる項目が残ります。この方式を巡る動きはニュースで取り上げました。

付け方に優劣はありません。抗体がチオール化や還元に耐えるか、反応基付きの脂質をGMP医薬品を一定の品質で安全に造るために守るべき製造・品質管理の基準（適正製造規範）です。詳しく →で調達できるか、向きをどこまで揃える必要があるかで選びます。

従来の3項目の限界 ― 粒子径・PDI・封入率が答えないこと

抗体を付けたあとも、粒子径、PDI、封入率は測ります。ただしこの3項目は、抗体が付いたかどうかを知りません。

まず測る時点です。ポストインサーションは作ったあとの工程なので、混合直後の封入率は最終製品の値ではありません。規格に置くのは、抗体を付けて精製したあとの値です。粒子径は、抗体の分だけ大きくなりえます。CDMOのProBioの資料は、tLNPでは粒子径を100 nm未満に収めるのが一般的で、Fab、scFv重鎖と軽鎖の可変ドメインを短いペプチドリンカーでつないだ1本鎖の抗体フラグメント。多価化しやすい。詳しく →、VHH のような小さい断片がよく使われるとしています。理屈の上では、100 nmという枠が、全長IgGより小さい断片を後押しします。付ける前後を同じ装置、同じ希釈、同じ時点で測り、差を見ます。測り方はLNPの粒子径とPDIとLNPの封入率に書きました。

PDIの読み方にも落とし穴があります。PDIが0.1台なら粒子は揃っている、という読み方は、tLNPでは半分しか当たりません。PDIが表すのは大きさの揃い方で、抗体の本数の揃い方ではないからです。Waters のポスターは、抗体を結ぶ量を増やすほど、電荷検出質量分析（CDMS）で見た粒子の分布が広がり、いくつもの部分集団に分かれると報告しました。DLSやRiboGreenDNAやRNAに結合して蛍光を出す色素です。核酸の量を高感度で測ったり、電気泳動で見えるようにするために使います。詳しく →のように平均を出す手法では、見えない違いです。

DLS溶液中の粒子がブラウン運動で散乱させる光の揺らぎから、タンパク質や凝集体の粒径分布を測る手法です。凝集の有無を素早く確認できます。詳しく →には Malvern Panalytical の Zetasizer、Wyatt の DynaPro、Unchained Labs の Stunner があります。NTA個々のナノ粒子の動きを一粒ずつ追跡し、粒径と数（濃度）を求める手法です。ウイルスやエクソソーム、微小な凝集体の計測に使います。詳しく →の NanoSight Pro は散乱と蛍光の両モードを持ちます。蛍光で標識した抗体を使えば、抗体を持つ粒子の割合を数える手がかりになる、というのが編集部の見立てで、妥当性は自社で確かめます。ゼータ電位も測れる装置が多く、マレイミドは加水分解で開環するとカルボキシ基を持つため、表面の負電荷が増えて反応基の失活を映す可能性があります。感度は自社のLNPで確かめます。

粒子径、PDI、封入率が確かめるのは、付ける工程が粒子を壊していないことです。抗体が付いたことの証拠には、別の項目が要ります。

抗体の数と向き ― 多いほどよいとは限らない

tLNPで新しく規格に置く項目の筆頭は、粒子1個あたりの抗体の数です。ADCのDAR抗体薬物複合体(ADC)で、抗体1分子に結合した薬物の平均数です。効果と安全性を左右するため測定する指標です。詳しく →（ADCのコンジュゲーションとDAR）に当たる項目で、平均だけでなく分布も見ます。

測り方は2段あります。ひとつは、タンパク質の総量と粒子の濃度から、平均の本数を出す方法です。粒子濃度は NTA で測れます。もうひとつは、粒子を1個ずつ見る方法です。リポソームの研究ですが、Rodallec らは2020年に、既知の量のIgG-κを付けたビーズで較正するフローサイトメトリー細胞を一つずつ測定し、表面マーカーや性質を調べる手法です。細胞の種類・純度・活性の確認に使います。詳しく →を組み、トラスツズマブを付けたイムノリポソーム1粒子あたり330、480、690本の3ロットを区別しました。結論は、本数は細かく調整する必要があり、最も多いロットが最も効くとは限らない、というものでした。同じ研究で、45日間の保管では、3ロットのうち1ロットだけ本数が大きく増えています。

多すぎることの代償も、粒子の外から見えています。Kappel らは2021年の ACS Nano で、ポリサルコシン系のナノ粒子に抗体を平均で2本、6本、12本付けて比べました。本数が増えるほど肝臓への集積が増え、その経路は肝類洞内皮細胞のFc受容体免疫細胞側にある抗体のFc領域の受け皿。結合の強さがADCCなどのエフェクター機能に関わる。詳しく →でした。F(ab')2断片にするか、本数を減らせば、細胞への特異的な結合は保ったまま、肝臓への集積を抑えられています。LNPではない粒子の結果です。同じ関係がLNPで成り立つかは、自社の粒子で確かめる項目です。

向きは、直接は測りにくい特性です。そこで結合活性から間接的に見ます。固定した抗原へのLNPの結合を、BLIセンサー先端に結合した分子の膜厚変化を光の干渉で捉え、抗体などの結合・解離のしやすさ（親和性）をリアルタイムで測る手法です。詳しく →（Sartorius の Octet）やSPR金属薄膜表面での光の共鳴変化を利用し、分子同士の結合と解離をリアルタイムに測る手法です。抗体などの親和性評価に広く使われます。詳しく →（Cytiva の Biacore）で測り、標的を持つ細胞と持たない細胞への結合を、フローサイトメトリーで測ります。粒子としての結合量を抗体の本数で割れば、付いている抗体のうち働いている割合が出ます。粒子の表面では抗体が多価で結合するので、抗体単体のKDと、粒子としての見かけの結合の強さは別の数字です（SPRとBLIの違い）。測定系がLNPで成り立つかは、自社で確かめます。

抗体の本数は、多いほど狙いに当たるわけではありません。最適な幅を先に決め、その幅に入っているかをロットごとに見ます。

付かなかった抗体を除く ― 膜の分画分子量と測り方

結合反応が終わった液には、粒子に付かなかった抗体と、抗体を結んだまま粒子に入らなかった脂質ミセルが残ります。

遊離抗体は、同じ受容体に結合しますが、核酸は運びません。理屈の上では、tLNPと受容体を奪い合い、見かけの効きを落とします。標的によっては、遊離抗体そのものが細胞に作用しうるので、投与する抗体の量は、粒子に付いた分と遊離の分を合わせて数えます。

除き方の例は、前の節の特許（US 12311033）にあります。SATA経路は Sepharose CL-4B のゲルろ過で、TCEP抗体のジスルフィド結合を部分的に還元してチオール基を作り出し、薬物を結び付けるための反応部位を露出させる試薬です。詳しく →経路はTFF膜面に液を平行に流しながらろ過し、目詰まりを抑えつつ濃縮やバッファ交換を行う限外ろ過（クロスフロー）装置一式です。詳しく →で精製していました。ゲルろ過は大きい粒子が先に出て、小さい遊離抗体があとから出てくる仕組みです。

ここにカタログの読み違いが潜んでいます。Cytiva の T-series TFFカセットは、Delta 100 kDa膜をRNAとLNPの用途に出しています。LNPを濃縮するなら適切な膜です。ただしIgGは約150 kDaで、公称の分画分子量が抗体より小さい膜は、抗体をほとんど通しません。Sartorius の Sartocon Hydrosart は、カタログの分画分子量が2から300 kDaまで並びます。LNPの濃縮に使っている膜を、そのまま遊離抗体の除去に使えるとは限りません。メーカーに聞くのは分画分子量の数字ではなく、その膜でのIgGのふるい係数です（ふるい係数とは）。

透析ろ過の回数を増やすと、粒子のロスや粒子径の変化が起きないかも見るので、除去のあとに粒子径、PDI、封入率を測り直します。残った遊離抗体は、粒子と遊離抗体をサイズ排除で分け、遊離側をELISAやUVで定量して、全抗体量に対する割合で規格に置く、というのが組み立ての一案です。ここも妥当性は自社で確かめます。

遊離抗体を除けるかは、膜の分画分子量が抗体より十分に大きいかで、先に決まります。

狙った細胞に届くか ― 細胞での効き目と保管中の変化

ここまでは粒子の側の項目です。最後に、抗体を付けた目的を直接確かめる試験が要ります。

標的を持つ細胞と持たない細胞の両方にtLNPを加え、ペイロードの発現を比べます。CARのmRNAなら、CARを出した細胞の割合を、フローサイトメトリーで見ます。Rurik らの例ではCARの発現が48時間以内に現れ、数日で消えたので、読み取る時点は先に決めておきます。装置は BD の FACSymphony A5 SE や Beckman Coulter の CytoFLEX などです。初代のT細胞を使うなら、ドナーによる差が出ます。参照ロットを同じプレートに置き、相対力価で読むと、ロット間差が粒子の側にあるのか、細胞の側にあるのかを切り分けられます（バイオアッセイ（力価試験）、標準物質の設定）。

投与後の分布は、動物でしか見えません。ロットリリースには使えないので、細胞での効き目と、動物での分布を結びつける開発段階のデータを、規格の根拠に置きます。

保管中の変化も、従来のLNPにはなかった項目です。マレイミドの失活は、水に触れる工程と保管のたびに進みえます。結んだあとも、チオエーテル結合の逆反応で抗体が外れる経路が残ります。安定性試験には、粒子径と封入率に加えて、抗体の本数、遊離抗体、結合活性を時点ごとに入れます。凍結や凍結乾燥を使うなら、その前後で同じ項目を比べます。LNPの側はmRNA-LNPの凍結乾燥と保存緩衝液と凍結融解に、抗体の側の考え方はICH Q5Cにあります。

抗体が付いていることと、狙った細胞で働くことは、別の確認です。粒子の項目が揃っていても、効き目の試験は省けません。

確認の順番 ― tLNPを評価・開発するときのCMCチェックリスト

上から順に決めると、手戻りが減ります。供給元への仕様確認や、受託先との打ち合わせに、そのまま使えます。

1. 先に、狙う細胞の受容体と、抗体の形を決めます。全長IgG、F(ab')2、Fab、scFv、VHH のどれにするかです。全長IgGはFc部分を持つため、肝臓のFc受容体に捕まる懸念があり、100 nm未満という粒子径の枠にも関わります。
2. 次に、付け方を決めます。ポストインサーション、ワンポット、クリック、Fc捕捉のどれかです。抗体がチオール化や部分還元に耐えるか、抗体を差し替える計画があるか、向きの制御をどこまで求めるかが材料です。
3. 反応基付きPEG脂質の供給元（Avanti、日油、Merck、Corden Pharma など）に、グレード、反応基の活性割合の規格、保管条件、ロット間差を聞きます。
4. 抗体は独立した原料として受け入れます。製造元、純度と凝集体、エンドトキシンの規格、供給の継続性を決め、抗体とtLNPの製造所が違うなら、受け入れ試験をどちらの品質システムで持つかも決めます。
5. 付ける工程の条件（温度、時間、抗体と反応基のモル比、pH）を、重要工程パラメータの候補として洗い出します。遊離抗体の除去用の膜は、IgGのふるい係数から選びます。
6. 規格案を、粒子の側と抗体の側に分けて置きます。粒子の側は、粒子径、PDI、封入率を、抗体を付けて精製したあとの値で規格に置きます。抗体の側は、1粒子あたりの本数とその分布、遊離抗体の割合、結合活性です。
7. 効き目の試験として、標的を持つ細胞と持たない細胞での送達を、参照ロットと並べて測ります。
8. 安定性試験に、抗体の本数、遊離抗体、結合活性を加えます。凍結や凍結乾燥を使うなら、その前後で同じ項目を比べます。
9. 最後に、変更管理の線を引きます。抗体のクローン、断片の形、反応基付き脂質のロットやメーカーを変えたとき、どこまで再試験するかを先に決めておきます。

装置と原料を探すときは、ナノ粒子製剤システム、LNPの粒子特性評価、TFFカセット、SPR、フローサイトメーターのページが入口です。

参考文献

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• Breda L, et al. In vivo hematopoietic stem cell modification by mRNA delivery. Science. 2023（DOI 10.1126/science.ade6967。CHOPの発表）
• Shi D, Toyonaga S, Anderson DG. In vivo RNA delivery to hematopoietic stem and progenitor cells via targeted lipid nanoparticles. Nano Lett. 2023.（CD117を狙うLNP。Cre mRNA 1 mg/kg）
• Capstan Therapeutics, Announces Initiation of Phase 1 Trial of Lead In Vivo CAR T Therapy CPTX2309 for Treating Autoimmune Disease（2025年6月。健康な人を対象にした第1相）
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• Antibody-functionalized lipid nanocarriers for RNA-based cancer gene therapy: advances and challenges in targeted delivery. Nanoscale Adv. 2025.（部位特異的な結合、断片、製造上の課題の総説）
• PMC10368001, Table 1（LNPへの標的リガンドのポストインサーションを整理したレビューの表。CD4、CD5、CD3の例）
• Oswald M, Geissler S, Goepferich A. Determination of the activity of maleimide-functionalized phospholipids during preparation of liposomes. Int J Pharm. 2016;514(1):93-102.（マレイミド活性の63%、32%、76%。リポソーム）
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• Waters, Multimodal Characterization of Targeted Lipid Nanoparticles Using Charge Detection MS and Orthogonal Separation Techniques（2026年のポスター。メーカー発表）
• ProBio, Process Development Challenges for tLNPs（CDMOの資料。粒子径、断片、抗体の向きと本数の課題）
• US 12311033, Lipid nanoparticle formulations and compositions（Capstan Therapeutics の特許。SATAとTCEPによるチオール導入、Sepharose CL-4B のゲルろ過とTFFによる精製の記述）
• Avanti, DSPE-PEG(2000) Maleimide（880126P）、DSPE-PEG(2000) DBCO（880229P）。Croda, Strengthening Life Sciences with the acquisition of Avanti Polar Lipids（2020年8月）