LNP（脂質ナノ粒子）とは？4つの脂質の役割と、肝臓に集まる理由

ただし、4種類が同じでも、どの脂質をどの比で混ぜ、どう混ぜたかで、できる粒子は変わります。粒子の大きさ、核酸が包まれた割合、細胞に届いたあとに核酸が細胞質へ出られる割合が動きます。肝臓に集まる理由も、脂質が肝臓を好むからではありません。血中のアポリポタンパク質脂質とタンパク質の複合体。EVと密度やサイズが近く、精製で分離しにくい夾雑物になる。詳しく →E（ApoE）が粒子の表面に吸着し、肝細胞のLDL受容体を介して取り込まれるからです。そのApoEが付くかどうかは、4種類のうちで入る量がいちばん少ないPEG脂質LNP表面を覆い、安定性や体内動態を調整する脂質。詳しく →が、どれだけ速く粒子から抜けるかに関わります。肝細胞以外へ届けたいときは、この経路とは別の入口を、粒子の側に用意する必要があります。

この記事では、LNPが何からできているかを示したうえで、核酸を脂質で包む理由、4つの脂質の役割、体の中での動き、作り方、品質で見る項目、実際に使われている薬、肝臓以外へ届ける工夫を順に説明します。

LNPとは ― 核酸を包んだ脂質の粒

LNPは、核酸を脂質で包んだ粒子です。中に入れる核酸は1種類ではありません。

mRNAを入れれば、細胞がその配列を読んで目的のタンパク質を作ります。siRNAを入れれば、細胞内のRNA干渉二本鎖RNAが相補的なmRNAを分解し、遺伝子発現を抑える仕組み。詳しく →という仕組みに取り込まれ、配列の合うmRNAが切られます。包む側の作りは、どちらでも共通です。使う脂質も同じ4種類です。

できた粒子は、液のまま凍結したり、凍結乾燥製剤から水分を抜いて乾燥させ、長期安定性を高めた剤形。使用時に溶かして戻す。詳しく →したりして保存します。脂質は温度が上がると分解や粒子径の変化が進むので、保存と輸送の条件まで含めて、はじめて製剤として成り立ちます（mRNA-LNPの凍結乾燥とコールドチェーン）。

では、なぜ核酸をわざわざ脂質で包むのでしょうか。

核酸を脂質で包む理由 ― 分解と負電荷

核酸は、裸のままでは薬として働きにくい分子です。理由は2つあります。

1つは酵素です。血液の中にはリボヌクレアーゼ（RNAを切る酵素）があり、むき出しのRNAは、標的の細胞に着く前に切られます。

もう1つは電荷です。核酸はリン酸基を背骨に持つので、分子全体として強い負電荷を帯びています。細胞膜の外側も負に帯電しているため、両者は反発します。mRNAは1本で数千塩基に達する大きな分子でもあります。自力で細胞膜を通り抜けることは、ほとんどできません。

LNPは、この2つに同時に効きます。脂質の膜で囲んで酵素から隔て、粒子ごと細胞に取り込ませます。核酸医薬siRNAやASOなど核酸を用い、標的mRNAを分解・抑制して効かせる医薬。詳しく →の運び手としてLNPが使われてきた理由の一つが、この2点に同時に対処できることです。

siRNAには、脂質を使わない届け方もあります。N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）という糖を核酸に直接つなぎ、肝細胞のアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）肝細胞表面に多く発現する受容体。GalNAcが結合し、核酸を肝細胞へ取り込ませる入口になる。詳しく →に渡す方法です（GalNAc結合siRNA）。運び方の選択肢は、包むか、つなぐかに分かれます。

ただし、包んでも、核酸が働くのは細胞質まで出られた分だけです。LNPは、分解と電荷という2つの問題を解く代わりに、エンドソーム細胞が外部から取り込んだ物質を包む小胞。内部が酸性化し、抗体はここでFcRnに結合する。詳しく →から細胞質細胞内部の区画。大腸菌では還元的で、そのままではジスルフィド結合ができにくい。詳しく →へ出るという関門を1つ増やします。

4つの脂質の役割

LNPに入る脂質は、役割の違う4種類です。

中心はイオン化脂質です。周囲のpHで電荷が変わる脂質で、酸性では正に帯電し、中性ではほとんど電荷を持ちません。粒子を作るときは酸性の水の中で負電荷の核酸と結び、血液の中では電荷を失い、細胞に取り込まれた先の酸性の環境で、また正電荷に戻ります。この切り替えの境目を表す数字が見かけのpKaLNPなど粒子として組み上がった状態で観測される見かけのpKaで、測定法や条件によって値が変わる設計指標。詳しく →で、承認品や臨床品ではおおむね6〜7に集まります（LNPのイオン化脂質はなぜpKa6〜7か）。

リン脂質とコレステロールは、粒子の形を保つ側です。リン脂質が膜の骨格を作り、コレステロールが脂質のすき間を埋めて粒子に剛性を与えます。核酸と静電的に結びつく成分ではありません。ただし、どちらの割合も、粒子の安定性や、細胞内で核酸が放出される効率に影響します。

PEG脂質は、入る量がいちばん少ない成分です。水に馴染むポリエチレングリコールの鎖を粒子の外へ生やし、粒子同士がくっつくのを防いで、血中にとどまる時間を延ばします。Muiらの2013年の報告は、PEG脂質が1.5モル%のとき、アルキル鎖の長さが肝臓での遺伝子抑制にほとんど影響しないとしています。2.5〜3.5モル%まで増やすと、炭素18の長い鎖では抑制が大きく落ち、炭素14では落ちませんでした。割合がいちばん小さい成分ですが、血中での挙動に関わります。

体の中での動き ― ApoEとLDL受容体

静脈から入れたLNPは、3つの段を踏んで細胞質に届きます。

最初の段は、PEG脂質が抜けることです。PEG脂質は粒子に固定されているのではなく、血漿のリポタンパク質へ少しずつ移っていきます。先に挙げたMuiらの報告は、アルキル鎖が14、16、18炭素のPEG脂質で、移る速さが違うことを測っています。粒子の表面は、投与した直後と、血中をめぐったあとで同じではありません。

次の段が、ApoEの吸着です。PEG脂質が抜けて表面が露出すると、血中のアポリポタンパク質E（ApoE）が粒子に付きます。ApoEは、もともと血中の脂質を運ぶリポタンパク質の成分で、肝細胞への取り込みを担うタンパク質です。Akincらの2010年の報告は、ApoEを欠いたマウスと、LDL受容体を欠いたマウスで、イオン化脂質のLNPによる遺伝子抑制が落ちることを示しました。同じ報告では、電荷が固定されたカチオン性脂質pHによらず常に正電荷を持つ脂質。血中成分や細胞膜と強く相互作用し、毒性や速いクリアランスを招きやすい。のLNPに、このApoEへの依存が見られませんでした。粒子に肝臓を選ぶ仕組みが入っているのではなく、体が脂質を運ぶ経路に乗る形で取り込まれます。

最後の段が、エンドソームからの脱出です。取り込まれた粒子は、エンドソーム（細胞が取り込んだものを包む袋）の中に入ります。袋の中が酸性になるとイオン化薬分子が水溶液中で電荷を帯びたイオン型と電荷を持たない非イオン型に分かれる現象で、体内のpH環境によって割合が変化する。詳しく →脂質が正電荷を帯び、袋の膜にある負電荷の脂質と引き合って、膜を壊します。ここを抜けた核酸だけが働きます。siRNAを包んだLNPを調べたGilleronらの2013年の研究では、細胞質まで出られたのは、取り込まれた量の1〜2%程度と見積もられました。脱出が起きるのは、粒子が初期エンドソームと後期エンドソームの両方の性質を持つ、短い間に限られました（イオン化脂質のpKaとエンドソーム脱出）。

肝臓に集まるのは、脂質が肝臓を選んでいるからではありません。血中のApoEが粒子に吸着し、肝細胞のLDL受容体に渡されるからです。

LNPの作り方

LNPは、反応で組み立てるのではなく、混ぜた瞬間にできます。

4種類の脂質をエタノールに溶かし、核酸を含む酸性の緩衝液溶液のpHを一定範囲に保つために使用される弱酸と共役塩基の混合溶液。詳しく →と急速に混ぜます。エタノールが薄まると脂質は溶けきれなくなり、自分から集まって粒子を作ります。これが自己集合です。水相を酸性にするのは、イオン化脂質を正電荷にして、負電荷の核酸を粒子の中に取り込ませるためです。

自己集合は数十ミリ秒で進むと見積もられています。混ざりきる時間がそれより短ければ、脂質はほぼ同じ条件で一斉に集まり、粒子の大きさが揃います。混ざるのが遅いと、場所ごとに濃さの差ができ、粒子径が広がります。だから装置には、マイクロ流体の細い流路や、2つの液を正面から衝突させるインピンジメントジェットのように、速く均一に混ぜられるものを使います（LNPの混合と自己集合）。

混ぜた直後の液は、エタノールが残り、pHも酸性のままです。TFF（タンジェンシャルフローろ過膜面に液を平行に流しながらろ過し、目詰まりを抑えつつ濃縮やバッファ交換を行う限外ろ過（クロスフロー）装置一式です。詳しく →）でエタノールを抜き、中性付近の緩衝液に換え、必要な濃度まで濃縮します。中性に戻ると、イオン化脂質はほとんど電荷を持たなくなります。最後に0.22 µmのフィルターで無菌ろ過細菌を止めることを実証したフィルターに液を通し、無菌のろ液を得る工程です。除菌ろ過・ろ過滅菌とも呼び、菌の数を下げるだけのバイオバーデン低減ろ過とは区別します。0.22µm前後の膜が広く使われます。詳しく →し、容器に充填します。粒子をフィルターに通す工程なので、目詰まり微粒子や凝集体、タンパク層が膜の孔を塞いでろ過が落ちる現象。プレフィルターでの前段保護が効く。詳しく →や粒子のロスが出ないかを先に確かめます（mRNA-LNPの製造工程）。

粒子の性質が決まるのは混合の一瞬で、それを製品にするのはあとの工程です。

品質で見る項目

測る対象は、粒子の側と中身の側に分かれます。

粒子の側は、粒子径と、そのばらつきを表すPDI（多分散指数）です。DLS（動的光散乱）溶液中の粒子のブラウン運動による散乱光のゆらぎから、粒子径や分布を求める手法。凝集の早期検出に使う。で測ります。DLSが返す平均は散乱強度で重みづけされ、大きな粒子の影響を受けやすいので、値が動いたときは、全体が育ったのか、少数の凝集体タンパク質分子どうしが結合してできた高分子量の集合体です。有効性や免疫原性に影響するため、その含量を測ります。詳しく →が混ざったのかを切り分けます（LNPの粒子径とPDI）。

中身の側は、まず封入率です。RNAに結びつくと光る色素（RiboGreen）を使い、粒子を壊す前と壊したあとで測った値の差から、粒子の中にある核酸の割合を出します。この色素は、無傷のmRNAと切れた断片を区別しません。mRNAが切れていないかは、キャピラリー電気泳動細い管（キャピラリー）に電圧をかけ、分子の電荷やサイズの違いによる移動速度の差で成分を分離する分析法です。詳しく →などで別に測ります（LNPの封入率、mRNAの完全性の測り方）。

脂質も測ります。LNPに使う脂質は紫外部に強い吸収を持たないので、HPLCに荷電化エアロゾル検出（CAD）を組み合わせて、4種類の含量と比を出します。分解物の同定には、LC-MS/MS液体クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせ、断片を一つずつ読んで配列や修飾部位を特定する手法。詳しく →を使います。探す相手は、イオン化脂質のN-オキシドや、リン脂質（DSPC）の加水分解物です。装置メーカーの資料は、イオン化脂質ALC-0315のN-オキシドが室温で増え、RNAを入れた粒子でとくに増えたと報告しています。

分解物は、効き目に関わります。イオン化脂質の不純物から生じるアルデヒドは、mRNAと反応して付加体を作り、翻訳を妨げます。Packerらの2021年の報告は、イオン対逆相HPLCイオン対試薬を使い疎水性の差で分ける液体クロマト。一本鎖と二本鎖RNAの分離やdsRNA除去に使われます。詳しく →でこの付加体を検出し、従来のmRNA純度製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →試験では検出しにくいと述べています。

品質の判定は、粒子の大きさと包まれた割合では終わりません。脂質と核酸が、作ったときのまま残っているかを、別の試験で確かめます。

実際に使われている薬

承認された薬は、siRNAとmRNAの2通りで出ています。

siRNAの例がオンパットロ（パチシラン）です。米FDAは2018年8月10日に承認しました。遺伝性トランスサイレチン型アミロイドーシスによる多発ニューロパチーが対象で、siRNA医薬としては最初の承認です。LNPで肝細胞へ届け、トランスサイレチン（TTR）というタンパク質が作られる量を下げます。ここまで説明した肝臓への集まり方が、この薬では作用の仕組みそのものです。

mRNAの例が、COVID-19のmRNAワクチンです。脂質は同じ4種類の構成で、イオン化脂質とPEG脂質が別の分子に替わります。2024年5月には、RSVのmRNAワクチンも米国で承認されました。COVID-19以外の疾患で承認された最初のmRNAワクチンで、脂質の構成は同じ4種類です。ただし、どちらも投与するのは筋肉で、静脈ではありません。肝細胞に集まるという先ほどの話は、筋肉への投与には当てはまりません。

肝臓以外へ届ける工夫

肝細胞以外を狙うなら、ApoEとLDL受容体の経路から外す必要があります。手は2通りあります。

1つは、粒子の外側に目印を付けることです。PEG脂質の先に抗体を結合させ、狙う細胞の抗原に取り付かせます。これが標的化LNPで、T細胞や造血幹細胞血液細胞のもとになる幹細胞。採取して体外で遺伝子を編集し、体内に戻す治療に使う。詳しく →を狙う報告が出ています。抗体を付けると、何本どの向きで付いたか、付かずに残った抗体がどれだけあるかという、測る項目が増えます（標的化LNPとは）。

もう1つは、脂質の組成そのものを変えることです。Chengらの2020年の報告は、4種類に5つ目の脂質を足す方法を示しました。恒久的に正電荷を持つDOTAPを10〜15%足すと脾臓、50%まで増やすと肺で、タンパク質が多く作られました。目印を付けずに、脂質の割合だけで届く臓器を動かした例です。

どちらも、公開されている結果の多くは動物のものです。標的化LNPでは2025年に第1相試験が始まりましたが、臨床での有効性はまだ示されていません。

肝臓に集まる性質は、肝細胞を狙う薬には好都合です。それ以外の細胞を狙うときには、最初に外す必要のある性質です。

次に確かめること

自分の処方に当てはめるときは、順に決めていきます。

最初に決めるのは、運ぶ核酸です。mRNAかsiRNAか、長さはどれだけか。包む核酸の長さが変わると、粒子にして測る見かけのpKa緩衝が最もよく効くpHの目安となる値。重炭酸緩衝系ではおおよそ6付近にあるとされる。詳しく →が0.1〜0.5ほど動いたという報告があります。

次に、狙う細胞を決めます。肝細胞なら、ApoEとLDL受容体の経路に乗せられます。それ以外なら、抗体を付けるのか、脂質の組成を変えるのかを選びます。

そのうえで、投与経路を決めます。静脈か、筋肉か。ここで、肝臓に集まる話が当てはまるかどうかが変わります。

最後に、測る時点を決めます。粒子径と封入率は、混合の直後と、ろ過のあとで値が変わることがあります。どの工程の液で測った値を規格に置くかを、先に決めておきます。脂質の分解物を測る方法も、同じ時期に用意します。

脂質の材料はイオン化脂質・LNP脂質材料、粒子を作る装置はナノ粒子作製装置、粒子の評価はLNPの粒子特性解析で比べられます。工程の全体はmRNA-LNPの製造工程、混合の条件はLNPの混合と自己集合にまとめました。

参考文献

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• Akinc A, Querbes W, De S, et al. Targeted delivery of RNAi therapeutics with endogenous and exogenous ligand-based mechanisms. Mol Ther. 2010;18(7):1357-1364.（ApoEが内在性のリガンドとして働くこと。ApoE欠損マウスとLDL受容体欠損マウスでの確認）
• Mui BL, Tam YK, Jayaraman M, et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Mol Ther Nucleic Acids. 2013;2:e139. DOI: 10.1038/mtna.2013.66（炭素14・16・18のPEG脂質が血漿リポタンパク質へ移る速さ。1.5モル%では鎖の長さの影響が小さく、2.5〜3.5モル%では炭素18で肝臓での遺伝子抑制が落ちること）
• Gilleron J, Querbes W, Zeigerer A, et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 2013;31(7):638-646.（細胞質へ放出されるsiRNAを1〜2%程度と見積もった研究）
• Packer M, Gyawali D, Yerabolu R, Schariter J, White P. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 2021;12:6777.（イオン化脂質由来のアルデヒドとmRNAの付加体。イオン対逆相HPLCでの検出）
• KNAUER, Targeted LC-MS/MS detection of lipid impurities in lipid nanoparticles（VPH0083）（メーカー資料。ALC-0315のN-オキシドが室温で増え、RNAを入れた粒子でとくに増えたこと、DSPCの加水分解物）
• Cheng Q, Wei T, Farbiak L, et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nat Nanotechnol. 2020;15(4):313-320. DOI: 10.1038/s41565-020-0669-6（5つ目の脂質。DOTAPの割合で発現の場所が肝臓から脾臓、肺へ移ること）
• FDA, FDA approves first-of-its-kind targeted RNA-based therapy to treat a rare disease（2018年8月10日の発表。オンパットロ／パチシランの承認と対象疾患。承認の根拠は第3相APOLLO試験）
• FDA, mRESVIA（mRNA-1345）の承認（2024年5月。RSVのmRNAワクチン。COVID-19以外の疾患で承認された最初のmRNAワクチンで、同社のCOVID-19ワクチンと同じ脂質構成のLNPを使う）
• Priss A, Lytvynenko O, Vanek V, et al. RNA Size and Structure Modulate the Apparent pKa of Ionizable Lipid Nanoparticles. Bioconjug Chem. DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.6c00177（包む核酸の長さと構造で、見かけのpKaが0.1〜0.5ほど動くこと）