キラルHPLCカラム、被覆型と固定化型の選び方と壊さない使い方

多糖系のキラルHPLCカラムには、選択子をシリカに物理的に被せた被覆型と、化学結合で固定した固定化型があります。選択子が同じでも、この載せ方の違いで、使える溶媒と、あとからできる条件検討の幅が決まります。

ただし、型を取り違えると、被覆型のカラムは流路に微量残った強い溶媒だけで壊れることがあります。分離しない化合物に当たったときも、粒子径の細かいカラムを探す前に、まず型と選択子を確かめます。

この記事では、分析担当と購買の担当に向けて、多糖系カラムの仕組み、被覆型と固定化型の違い、選ぶ順番、壊しやすい溶媒と添加剤を順に説明します。

1. 鏡像異性体を分けるカラムは、なぜ多糖系が主流なのか

鏡像の関係にある二つの分子（鏡像異性体）は、物理的な性質がほとんど同じです。通常の逆相カラム疎水性の固定相を使い、分子の疎水性の差で分離するHPLC用カラムで、純度確認や含量分析など幅広い分析に使われます。詳しく →では分かれません。それでも体内では別の化合物として振る舞い、片方だけが効く場合も、片方が有害な場合もあります。低分子原薬原薬。精製を終えた有効成分そのもので、製剤化する前の段階を指す。詳しく →では、不要な鏡像体の量が規格になることがあります（低分子原薬の品質管理）。

では、どう分けるのか。使うのはキラル固定相鏡像異性体（右手と左手のように重ならない分子）を分けるための固定相を詰めたカラムで、多糖類を用いたものが代表的です。詳しく →（CSP）を詰めたカラムで、シリカの粒子に、鏡像体の片方と相性のよい分子（選択子）を付けておき、相性の差で保持時間をずらします。

低分子原薬の開発で主流なのは、セルロースやアミロースの誘導体を選択子にした多糖系で、ダイセルのCHIRALPAKとCHIRALCELが代表です。多糖系のカラムを選ぶ軸は、次の2つです。

• 載せ方⁠：選択子をシリカにどう載せるかで、使える溶媒が決まります。
• 骨格⁠：選択子の骨格が何かで、分けられる化合物が決まります。

2. 重要：同じ選択子でも、被覆型と固定化型で使える溶媒はどう変わるのか

たとえば、ダイセルのCHIRALPAK AD-HとIAは、どちらもアミロース tris(3,5-ジメチルフェニルカルバメート)を選択子にしたカラムで、違うのはシリカへの載せ方だけです。AD-Hは被覆型、IAは固定化型にあたります。

• 被覆型⁠：多糖の誘導体をシリカの表面に物理的に被せた構造です。CHIRALPAK AD-H（アミロース系）、CHIRALCEL OD-H（セルロース系）、PhenomenexのLux Amylose-1などが当たります。
• 固定化型⁠：同じ選択子をシリカに化学結合で固定した構造です。AD-Hと同じ選択子のCHIRALPAK IA、OD-Hと同じ選択子のIB、セルロース tris(3,5-ジクロロフェニルカルバメート)のICがあります。

被覆型の弱点は、多糖が強い溶媒に溶けることです。ダイセルのAD-H取扱説明書（2013年7月版）は、アセトン、クロロホルム、DMF、DMSO、酢酸エチル、塩化メチレン、THFを、流路に残るだけで固定相を壊すおそれのある溶媒として挙げ、微量の残りでも危ないと注意しています。

同じ説明書は、カラムをつなぐ前に、注入口とサンプルループを含む装置全体をカラムと相性のよい溶媒で洗うことと、オートサンプラーの洗浄液も替えることを求めています。出荷時の溶媒は、ヘキサンと2-プロパノールの9対1です。

一方、固定化型は選択子が溶け出しません。強い溶媒を、移動相クロマトグラフィーにおいて試料を運ぶ液体（または気体）で、組成や流量が分離性能に大きく影響する。詳しく →にも試料の溶解にも使えます。ダイセルのIB取扱説明書は、混和する有機溶媒を、クロロホルム、酢酸エチル、THF、MtBEを含めて使えると案内しています。

選択子が同じでも、載せ方が違えば、使える溶媒が違うカラムです。型を取り違えると、1回の注入で使えなくなることがあります。

3. 溶媒、選択子、公定書、スケールの順に、どう選ぶのか

最初に決めるのは溶媒です。試料が何に溶け、移動相に何を使いたいかを確かめます。ヘキサンとアルコールで足りるなら、実績の厚い被覆型のAD-HやOD-Hから始められます。試料がヘキサンに溶けにくいときや、逆相や極性有機溶媒の条件へ行き来するかもしれないときは、最初から固定化型を選ぶと手戻りが少なくなります。

次に決めるのは選択子です。セルロース系とアミロース系は選択性が違い、片方で分離しない化合物がもう片方で分かれることがあります。

置換基の違う選択子もあり、CHIRALCEL OJ-Hはセルロース tris(4-メチルベンゾエート)、ICは電子を引きつけるジクロロフェニル基を持つ選択子です。固定化型は溶媒を替えて試せるので、骨格と置換基の違う数本を並べるスクリーニングに向きます。

粒子径は、選択子の次に決めます。5 µmから3 µmに下げれば効率が上がり、同じ分離度クロマトグラフィーにおいて、隣り合う二つのピークが互いにどれだけ明確に分かれているかを示す無次元数値。詳しく →を短いカラムと短い時間で出せますが、選択性は変わりません。選択子が合っていない化合物は粒子を細かくしても分かれないので、分離が確認できてから、分析時間や分取量に合わせて決めます。

公定書や承認申請済みの方法に合わせるときは、充填剤の指定も確かめます。米国薬局方（USP）は充填剤をLコードで指定し、メーカーの製品表では、アミロース tris(3,5-ジメチルフェニルカルバメート)の被覆型がL51、固定化型がL99とされています。選択子が同じでも型が違えばコードが別なので、置き換えてよいかは方法の定めと、システム適合性試験系がきちんと動いていることを確認するための基準や試験。判定の信頼性を支える。詳しく →で確かめます。

分取まで行く見込みがあるなら、同じ選択子の太径品があるメーカーを優先します。NacalaiのCOSMOSIL CHiRAL 5Aには内径10 mmと20 mmの分取向けがあり、RegisのRegisPackは3 µm品もあって、HPLCとSFC超臨界状態の流体を移動相に使う分離法。キラル純度の測定などに用いられる。の両方に使えます。こうした製品なら、スクリーニングで見つけた選択子を変えずに、太いカラムへ移せます。

同じ選択子を別のメーカーから調達できる場合もあり、YMCのCHIRAL ARTシリーズは、IAやICと同じ系統の選択子です。ただし、化学構造が同じ選択子でも、充填やロットが違えば、実測の分離度まで同じとは限りません。切り替えるときは、手持ちの試料で分離度と保持時間を確かめます。

溶媒から決め、選択子は2つの骨格で試し、粒子径は最後に決めます。

4. 溶媒、添加剤、溶出順序で、どんな失敗が起きるのか

いちばん多いのは、被覆型に強い溶媒を持ち込むことです。移動相に使わなくても、試料をDMSOやTHFに溶かして注入する、オートサンプラーの洗浄液に残っている、前に使った人の溶媒が流路に残っている、といった入り方があります。ダイセルの説明書が微量でも危ないと書いているのは、このためです。症状は、分離度の低下やピーク形状の崩れとして現れます。

二つめは、酸や塩基の添加剤が残ることです。ジエチルアミンやトリフルオロ酢酸のような添加剤は、多糖系のカラムに残って保持や分離を変えることが知られています（メモリー効果）。

そのため、添加剤を替えたあとは、標準試料で保持時間とピーク形状が戻ったことを確かめてから使います。添加剤の種類ごとにカラムを決めておく運用が安全です。

三つめは、溶出順序を見ていないことです。添加剤の種類を替えただけで、鏡像体の溶出する順序が入れ替わった例も報告されています。

微量の鏡像体が主ピークの後ろに裾を引いて重なる条件では、定量が難しくなります。微量側が先に出る条件を選ぶと、低い量まで読みやすくなります（検出限界と定量限界）。

5. カラムを選ぶとき、メーカーに何を確かめるのか

カラムを選ぶときや、メーカーに見積もりと仕様を確認するときは、次の順に確かめます。

• 溶媒⁠：試料が何に溶けるかと、注入する溶媒にTHF、ジクロロメタン、DMSOなどの強い溶媒が入らないかを確かめる。移動相に使いたい溶媒と、将来、逆相や極性有機溶媒へ移す可能性があるかも確かめる。
• 選択子⁠：アミロース系とセルロース系の両方を含めて試す。メーカーには、その選択子で自社が使いたい溶媒が保証されているかを聞く。
• 公定書の指定⁠：公定書や既存の方法が、充填剤をLコードなどで指定していないかを確かめる。指定があるなら、被覆型か固定化型かまで合っているかを見る。
• スケール⁠：分析だけか、分取まで行くかを決め、同じ選択子の太径品があるかを確かめる。
• 装置と運用⁠：注入口、ループ、オートサンプラーの洗浄液に前の溶媒が残っていないかと、そのカラムで以前に使った添加剤を記録しているかを確かめる。微量の鏡像体が、主ピークの前に出るか後ろに出るかも見る。

メーカーと製品は、製品データベースのキラルカラムにまとまっています。キラル純度目的のエナンチオマーと望まない鏡像体の存在比を表す品質特性。立体中心をもつ原薬の光学的な純度を示す。詳しく →が規格に入る理由は低分子原薬の品質管理に、分析法を別の施設へ移すときの確認項目は分析法の移管にあります。通常の類縁物質の分析に使うRP-HPLCカラムとは、選ぶ軸が違います。

参考文献

• Daicel Chiral Technologies, CHIRALPAK AD-H 取扱説明書（Instruction Manual、2013年7月版、避ける溶媒と流路の洗浄）
• Daicel Chiral Technologies, CHIRALPAK IB 取扱説明書（固定化型で使える溶媒）
• Daicel Chiral Technologies, USP米国で医薬品・原料・試験法の公式基準を定める公定書で、製薬用水に関する規格も収載されている。詳しく → List of HPLC Columns（USPコードと選択子の対応）
• Welch Materials, Ultisil Amy-D（被覆型、USP L51） と Ultisil IMMA（固定化型、USP L99） の製品ページ
• Chromatography Today, Trouble with chiral separations（多糖系カラムの添加剤のメモリー効果）
• Phenomenex, Lux Chiral LC Column 製品情報（Amylose-1・Cellulose-2・i-Amylose-1の選択子構成）
• Regis Technologies, RegisPack / RegisCell 製品情報
• Nacalai Tesque, COSMOSIL CHiRAL シリーズ 製品情報（分析用・分取用グレード）
• YMC, CHIRAL ART シリーズ 製品情報