薬効・作用機序トピック 8/15
バイオマーカー・PD評価
作用が体内で起きているか（薬効・作用機序薬が効果を発揮する仕組み。抗体医薬ではADCCやCDCなどが該当し、アッセイで裏づける。詳しく →の発現）を、どのマーカーと測定法で読むか
7モダリティを比較61装置・試薬の代表例
モダリティ別の進め方（7比較）
モダリティアプローチ（手法）読み出し・指標留意点
抗体（mAb）標的占有薬が狙った標的に実際どれだけ結合しているかの度合い。標的占有とも呼ばれる。率（receptor occupancy, RO）をフローサイトメトリー細胞を一つずつ測定し、表面マーカーや性質を調べる手法です。細胞の種類・純度・活性の確認に使います。詳しく →で測定し、下流シグナル（リン酸化タンパク等）や標的経路のバイオマーカーを評価。可溶性標的なら遊離/総リガンド濃度をリガンド結合アッセイ（ELISA抗原と抗体の結合を酵素反応による発色などで検出し、目的の物質の有無や量を測る手法です。不純物や力価の測定に広く使われます。詳しく →等）で測定RO（%）、遊離標的濃度、下流シグナル・機能マーカーの変化ROアッセイは遊離受容体・総受容体・薬剤結合受容体のどれを測るか設計で明確化する必要があります。可溶性標的が薬剤と複合体を作る場合はTMDD（標的介在性薬物動態投与した薬が体内で吸収・分布・代謝・排泄されていく挙動。ADCではDARが大きく影響する。詳しく →）がPKにも影響します
ADC抗体側の標的結合（RO）に加え、放出ペイロードの薬理作用マーカーを評価。ペイロード機序に対応したマーカー（DNA損傷型ならγH2AX、微小管阻害型なら有糸分裂/アポトーシス細胞が遺伝的プログラムに従って自発的に死に至る過程で、壊死とは異なり膜の完全性が初期段階では保たれる。詳しく →指標など）をIHC/フローで測定。ペイロード濃度はLC-MS液体クロマトグラフで成分を分離したうえで質量分析計にかけ、分子量を測って物質の同定や定量を行う手法です。詳しく →/MSで定量RO、ペイロード薬理マーカー（例：γH2AX等のDNA損傷マーカー、有糸分裂/アポトーシス細胞が遺伝的プログラムに従って自発的に死に至る過程で、壊死とは異なり膜の完全性が初期段階では保たれる。詳しく →指標）、遊離ペイロード濃度抗体・コンジュゲート・遊離ペイロードを区別したバイオアナリシス設計が前提になります。どのマーカーを選ぶかはペイロードの作用機序薬が効果を発揮する仕組み。抗体医薬ではADCCやCDCなどが該当し、アッセイで裏づける。詳しく →（DNA損傷か微小管阻害か等）に依存します
mRNA-LNP導入mRNAから翻訳された産物（タンパク）の発現を評価。組織/血中の産物タンパクをELISA抗原と抗体の結合を酵素反応による発色などで検出し、目的の物質の有無や量を測る手法です。不純物や力価の測定に広く使われます。詳しく →・LC-MS液体クロマトグラフで成分を分離したうえで質量分析計にかけ、分子量を測って物質の同定や定量を行う手法です。詳しく →で定量し、必要に応じてmRNA量をRT-qPCRで測定。機能的マーカー（例：ワクチンなら抗原に対する免疫応答）も併用発現タンパク濃度（血中・組織）、導入mRNA量、機能的PD応答内因性タンパクと区別できるアッセイ（配列特異的検出やタグ）が必要な場合があります。発現は一過性で、投与後の時間経過（発現ピークと消失）を踏まえた採取設計が要ります
AAV（遺伝子治療）導入遺伝子ベクターで細胞に運んで働かせる目的の遺伝子。詳しく →（transgene）産物の発現とその持続を評価。血中/組織のtransgene産物タンパクをELISA抗原と抗体の結合を酵素反応による発色などで検出し、目的の物質の有無や量を測る手法です。不純物や力価の測定に広く使われます。詳しく →・LC-MS液体クロマトグラフで成分を分離したうえで質量分析計にかけ、分子量を測って物質の同定や定量を行う手法です。詳しく →で定量し、ベクターゲノムコピー数・mRNA発現をqPCR/ddPCR・RT-qPCRで測定。酵素補充型なら酵素活性を機能マーカーにtransgene産物タンパク濃度、酵素活性等の機能指標、ベクターゲノム/mRNA発現量と持続性発現の持続性（数か月〜長期）が重要な読み出しで、PKの概念が曝露から発現持続に置き換わります。単回投与が基本で、既存の抗AAV遺伝子治療で遺伝子を運ぶウイルスベクター。血清型によって集まりやすい組織が異なる。詳しく →中和抗体や投与後の免疫応答が発現・再投与可能性に影響します
siRNA・ASO（核酸）標的mRNAのノックダウン率を主要PDとして評価。標的mRNAをRT-qPCR/ddPCRで、標的タンパクをELISA抗原と抗体の結合を酵素反応による発色などで検出し、目的の物質の有無や量を測る手法です。不純物や力価の測定に広く使われます。詳しく →・LC-MS液体クロマトグラフで成分を分離したうえで質量分析計にかけ、分子量を測って物質の同定や定量を行う手法です。詳しく →で測定。ASO標的RNAに相補的な配列をもつ一本鎖の短い核酸。RNAに結合して働きを抑えたり書き換えたりする。詳しく →のスプライス調整型ではスプライシング産物の変化を評価標的mRNAノックダウン率（%）、標的タンパク減少率、スプライス産物比作用組織での測定が重要です。特にGalNAc結合siRNA二本鎖の短いRNAで、RISC（Ago2）を介して標的mRNAを分解する核酸医薬。ASOと製造基盤を共有する。詳しく →は肝細胞への取り込みに設計されており、肝が主な作用組織となるため、血中マーカーが標的組織の作用を代表するか確認が必要です
細胞治療（CAR-T・iPS）投与細胞の体内動態（拡大・持続）をqPCR/ddPCR（ベクター/導入遺伝子ベクターで細胞に運んで働かせる目的の遺伝子。詳しく →コピー数）やフローサイトメトリー細胞を一つずつ測定し、表面マーカーや性質を調べる手法です。細胞の種類・純度・活性の確認に使います。詳しく →で追跡。薬理マーカーとして血中サイトカイン細胞が放出する免疫の情報伝達物質。細胞治療では効果と安全性のリードアウトになる。詳しく →（ELISA抗原と抗体の結合を酵素反応による発色などで検出し、目的の物質の有無や量を測る手法です。不純物や力価の測定に広く使われます。詳しく →/多項目イムノアッセイ）や標的細胞の消失（例：CD19 CAR-T患者や健常ドナーのT細胞にCAR（キメラ抗原受容体）を導入し、がん細胞を攻撃させる細胞治療。詳しく →でのB細胞アプラジア）を評価細胞の拡大ピーク・持続期間、サイトカイン細胞が放出する免疫の情報伝達物質。細胞治療では効果と安全性のリードアウトになる。詳しく →濃度、B細胞アプラジア等の標的細胞消失生きた細胞が増殖・持続するためPKが従来の濃度時間曲線と異なり、細胞動態そのものが曝露指標になります
共通の考え方いずれのモダリティでも、標的への到達（曝露）と作用（PD応答）を分けて捉え、PK/PD関係として関連づける考え方は共通です。可能なら近位マーカー（標的そのものへの作用）と遠位マーカー（下流・機能的応答）を組み合わせ、測定法はfit-for-purposeで妥当性を確認したアッセイで定量します。
このトピックで使う装置・試薬61件
装置・試薬はモダリティをまたいで共通のものが多く、同じ名前が何度も出てきます。
抗体9件
装置・機器5
- フローサイトメーター（標的占有率RO測定）BD FACSymphony A5 SE、Cytek Aurora（5L）、Beckman Coulter CytoFLEX / CytoFLEX S、BD FACSCanto II
- 電気化学発光（ECL）マルチプレックスリーダー（リン酸化タンパク・下流シグナル）Meso Scale Discovery MESO QuickPlex SQ 120、MSD MESO SECTOR S 600
- マイクロプレートリーダー（ELISA/リガンド結合アッセイ）Molecular Devices SpectraMax iD5、BMG LABTECH CLARIOstar Plus、Tecan Infinite M Nano+
- 自動化ナノリットル免疫測定システム（遊離/総リガンド定量）Gyros Protein Technologies Gyrolab xPlore / xPand、Bio-Rad Bio-Plex 200（Luminex）
- 超高感度シングルモレキュール免疫測定装置（低濃度バイオマーカー）Quanterix Simoa HD-X、Quanterix SR-X
試薬・キット4
- 蛍光標識抗体（RO測定用・受容体/薬剤検出）BD Biosciences BD Horizon 各種蛍光標識mAb、BioLegend PE/APC標識抗体、Thermo Fisher eBioscience 標識抗体
- リン酸化タンパク定量アッセイキット（下流シグナル）MSD Phospho/Total Protein Assays（pERK/pSTAT等）、Thermo Fisher ProcartaPlex phospho-protein パネル、Cell Signaling Technology PathScan ELISA
- 遊離/総リガンド定量ELISAキット（可溶性標的）R&D Systems Quantikine ELISA、Thermo Fisher Human ELISA Kit、Gyros Gyrolab キット化試薬
- 細胞染色・生死判別試薬（フロー前処理）Thermo Fisher LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain、BD FACS Lysing Solution、BioLegend Zombie Fixable Viability Kit
ADC10件
装置・機器5
- フローサイトメーター（抗体側RO・アポトーシス/有糸分裂指標）BD FACSymphony A5 SE、Beckman Coulter CytoFLEX、Cytek Aurora
- 自動IHC染色装置（DNA損傷γH2AX・アポトーシスマーカー）Leica BOND-RX / BOND-III、Roche VENTANA DISCOVERY ULTRA、Roche VENTANA BenchMark
- デジタルパソロジー・スライドスキャナ（IHC定量画像解析）Leica Aperio GT 450、Hamamatsu NanoZoomer S360、Roche VENTANA DP 200
- LC-MS/MS（放出ペイロード濃度定量・トリプル四重極）SCIEX Triple Quad 7500 / API 5000、Waters Xevo TQ-XS / TQ-S、Thermo Fisher TSQ Altis
- UPLC/HPLC（LC-MS/MS前段分離）Waters ACQUITY UPLC I-Class、Agilent 1290 Infinity II、Thermo Fisher Vanquish
試薬・キット5
- 抗γH2AX（Ser139）抗体（DNA損傷型ペイロード）Cell Signaling Technology Phospho-Histone H2A.X (Ser139) (20E3)、Sigma-Aldrich/Millipore Anti-phospho-Histone H2A.X (JBW301)、Thermo Fisher Invitrogen (RM224)
- アポトーシス検出IHC試薬（微小管阻害/一般毒性）Cell Signaling Technology SignalStain Cleaved Caspase-3 (Asp175) IHC Kit、Abcam anti-cleaved Caspase-3 antibody
- 有糸分裂・増殖マーカー抗体（微小管阻害型ペイロード）Cell Signaling Technology Phospho-Histone H3 (Ser10)、Agilent Dako Ki-67 (MIB-1)、Abcam anti-alpha Tubulin
- IHC検出・可視化キット（DAB発色）Vector Laboratories ImmPRESS / DAB Substrate Kit、Agilent Dako EnVision FLEX、Roche VENTANA DISCOVERY DAB
- LC-MS/MS用ペイロード標準品・内標準・SPE消耗品MMAE/DM1 等ペイロード認証標準品（各社）、Waters Oasis HLB 固相抽出プレート、安定同位体標識内標準
mRNA-LNP9件
装置・機器5
- マイクロプレートリーダー（産物タンパクELISA）Molecular Devices SpectraMax iD5、BMG LABTECH CLARIOstar Plus、Tecan Infinite 200 PRO
- 超高感度免疫測定装置（低発現産物タンパク）Quanterix Simoa HD-X、MSD MESO QuickPlex SQ 120、Gyros Gyrolab xPlore
- LC-MS/MS（翻訳産物タンパクの定量）SCIEX Triple Quad 7500、Thermo Fisher TSQ Altis、Waters Xevo TQ-XS
- リアルタイムPCRシステム（導入mRNA量RT-qPCR）Thermo Fisher Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex、Bio-Rad CFX96 / CFX Opus、Roche LightCycler 480
- 免疫応答評価用フローサイトメーター/ELISpotリーダー（機能的マーカー）Cytek Aurora、BD FACSymphony、CTL ImmunoSpot S6 Analyzer
試薬・キット4
- 産物タンパク定量ELISA/免疫測定キットR&D Systems Quantikine ELISA、Thermo Fisher Human ELISA Kit、MSD U-PLEX/R-PLEX アッセイ
- RNA抽出・逆転写・qPCRマスターミックス（mRNA定量）Qiagen RNeasy Kit、Thermo Fisher TaqMan Gene Expression Assays / TaqMan Fast Advanced Master Mix、Bio-Rad iScript / SsoAdvanced
- 抗原特異的免疫応答評価試薬（ワクチン用途）Mabtech ELISpot Kit（IFN-γ）、抗原ペプチドプール、BD Cytometric Bead Array（サイトカイン）
- LC-MS用トリプシン消化・ペプチド定量試薬Promega Sequencing Grade Modified Trypsin、安定同位体標識ペプチド内標準、Waters Oasis 固相抽出
AAV9件
装置・機器5
- デジタルPCR（ddPCR）システム（ベクターゲノムコピー数）Bio-Rad QX200 / QX600 Droplet Digital PCR System、Bio-Rad QX ONE、Thermo Fisher QuantStudio Absolute Q
- リアルタイムPCRシステム（VCN・transgene mRNA RT-qPCR）Thermo Fisher Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex、Bio-Rad CFX96、Roche LightCycler 480
- マイクロプレートリーダー（transgene産物ELISA・酵素活性）Molecular Devices SpectraMax iD5、BMG LABTECH CLARIOstar Plus、Tecan Infinite M Nano+
- 超高感度免疫測定/自動免疫測定装置（低発現産物タンパク）Quanterix Simoa HD-X、Gyros Gyrolab xPand、MSD MESO SECTOR S 600
- LC-MS/MS（transgene産物タンパク定量）SCIEX Triple Quad 7500、Waters Xevo TQ-XS、Thermo Fisher TSQ Altis
試薬・キット4
- ddPCR/qPCR試薬・プローブ（ベクターゲノム/transgene）Bio-Rad ddPCR Supermix for Probes / AAV ddPCR Assays、Thermo Fisher TaqMan Gene Expression Assays、Bio-Rad Droplet Generation Oil
- 核酸抽出キット（組織/血中DNA・RNA）Qiagen DNeasy / RNeasy Kit、Thermo Fisher MagMAX Nucleic Acid Isolation Kit
- transgene産物タンパク定量ELISAキットR&D Systems Quantikine ELISA、Thermo Fisher Invitrogen ELISA Kit、MSD U-PLEX アッセイ
- 酵素活性測定試薬（酵素補充型の機能マーカー）Sigma-Aldrich 蛍光/発色基質（4-MU 誘導体等）、各酵素向け Activity Assay Kit（Abcam等）
核酸8件
装置・機器5
- デジタルPCR（ddPCR）システム（標的mRNAノックダウン絶対定量）Bio-Rad QX200 / QX600 Droplet Digital PCR System、Thermo Fisher QuantStudio Absolute Q
- リアルタイムPCRシステム（標的mRNA RT-qPCR）Thermo Fisher Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex、Bio-Rad CFX96 / CFX Opus、Roche LightCycler 480
- マイクロプレートリーダー（標的タンパクELISA）Molecular Devices SpectraMax iD5、BMG LABTECH CLARIOstar Plus、Tecan Infinite 200 PRO
- 超高感度免疫測定装置（低発現標的タンパク）Quanterix Simoa HD-X、MSD MESO QuickPlex SQ 120、Gyros Gyrolab xPlore
- LC-MS/MS（標的タンパク・スプライシング産物補完定量）SCIEX Triple Quad 7500、Waters Xevo TQ-XS、Thermo Fisher TSQ Altis
試薬・キット3
- RNA抽出・逆転写・qPCR/ddPCR試薬（mRNAノックダウン）Qiagen RNeasy Kit、Thermo Fisher TaqMan Gene Expression Assays / High-Capacity cDNA RT Kit、Bio-Rad ddPCR Supermix for Probes
- 標的タンパク定量ELISA/免疫測定キットR&D Systems Quantikine ELISA、Thermo Fisher Human ELISA Kit、MSD U-PLEX/R-PLEX
- スプライシング産物解析試薬（ASOスプライス調整型）Thermo Fisher Custom TaqMan Assays（エクソン境界）、Bio-Rad ddPCR プローブ（アイソフォーム識別）
細胞治療9件
装置・機器5
- フローサイトメーター（投与細胞の拡大・持続、標的細胞消失/B細胞アプラジア追跡）BD FACSymphony A5 SE、Cytek Aurora、Beckman Coulter CytoFLEX / DxFLEX、BD FACSLyric
- デジタルPCR（ddPCR）システム（ベクター/導入遺伝子コピー数・体内動態）Bio-Rad QX200 / QX600 Droplet Digital PCR System、Thermo Fisher QuantStudio Absolute Q
- リアルタイムPCRシステム（transgene/ベクターqPCR）Thermo Fisher Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex、Bio-Rad CFX96、Roche LightCycler 480
- 多項目イムノアッセイ/ECL・Luminexリーダー（血中サイトカイン）MSD MESO QuickPlex SQ 120、Bio-Rad Bio-Plex 200、Luminex/Thermo Fisher xMAP INTELLIFLEX
- マイクロプレートリーダー/超高感度免疫測定（サイトカインELISA）Molecular Devices SpectraMax iD5、Quanterix Simoa HD-X、Tecan Infinite M Nano+
試薬・キット4
- 蛍光標識抗体パネル（CAR検出・免疫表現型・B細胞マーカー）BioLegend / BD Biosciences CD19・CD3・CD4・CD8 標識抗体、抗CAR検出試薬（抗idiotype/protein L）、Miltenyi Biotec CAR Detection Reagent（CD19/BCMA等 抗原特異的）
- サイトカイン多項目イムノアッセイキット（IL-6・IFN-γ・TNF-α等）MSD V-PLEX Proinflammatory Panel、Thermo Fisher ProcartaPlex Cytokine Panel、BioLegend LEGENDplex、BD Cytometric Bead Array
- ベクター/導入遺伝子コピー数定量PCR試薬Bio-Rad ddPCR Supermix for Probes、Thermo Fisher TaqMan Copy Number Assays、WPRE/導入遺伝子特異的プローブ
- 細胞処理・生死判別・溶血試薬（フロー前処理）Thermo Fisher LIVE/DEAD Fixable Stain、BD FACS Lysing Solution、BioLegend Zombie Viability Kit
低分子7件
装置・機器4
- 電気化学発光イムノアッセイ（微量PDマーカーの高感度定量）Meso Scale Discovery MESO QuickPlex SQ 120、MSD SECTORシリーズ
- キャピラリー電気泳動式ウエスタン（リン酸化タンパクの定量）Bio-Techne ProteinSimple Jess
- LC-MS/MS（内因性代謝物・基質の定量）SCIEX Triple Quad 7500、Thermo Fisher TSQ Altis
- リアルタイムPCR（遺伝子発現のPD評価）Thermo Fisher QuantStudio 7 Flex、Bio-Rad CFX Opus
試薬・キット3
- 電気化学発光アッセイキットMSD U-PLEX / V-PLEX アッセイ
- リン酸化特異抗体Cell Signaling Technology、Abcam
- 遺伝子発現アッセイThermo Fisher TaqMan Gene Expression Assays
規制・注意PDバイオアナリシスに使うアッセイには、目的に応じた妥当性確認（fit-for-purpose validation）が要ります。遺伝子治療・細胞治療では、ベクターや導入遺伝子産物の生体内分布と発現の持続まで評価の対象です。免疫作動性の分子なら、初回投与量の設定にMABEL（最小予測生物学的作用量）の考え方を使う点も踏まえます。
一次資料ICH S6(R1)（バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床安全性評価）、ICH M3(R2)（非臨床安全性試験の実施時期）、ICH S9（抗悪性腫瘍薬の非臨床評価）、ICH S12（遺伝子治療製品の非臨床生体内分布）。遺伝子治療・細胞治療はFDA Guidance for Industry「Preclinical Assessment of Investigational Cellular and Gene Therapy Products」およびEMAの遺伝子/細胞治療関連ガイドラインを参照。