EDTAとは？金属イオンを抱え込むと、何が止まるのか

EDTA（エチレンジアミン四酢酸）とは、カルシウムや鉄などの金属イオンを分子で抱え込み、ほかの物と反応できなくするキレート剤です。製剤の安定化、細胞の剥離、採血管の抗凝固、分析の試薬と用途は幅広いものの、どれも金属イオンを反応から外すという同じ働きを使っています。

一方で、入れれば必ず安定になる成分ではありません。抗体などのタンパク質の製剤では、鉄の存在下で EDTA がかえって酸化を進めたという報告もあり、どの金属を外したいのかで結果が変わります。

キレートの仕組みから始めて、用途ごとに外している金属、効かない条件や困る場面、使う前に確かめることへ進みます。

1. EDTAは、金属イオンをどうやって抱え込むのか

EDTAは、1つの分子の中の複数の部位で1つの金属イオンを同時に囲み、その金属がほかの物と反応できない形にします。

EDTA の分子には、4つのカルボキシ基と、電子の対を持つ2つのアミンがあります。Banfi らの総説によると、これらがカルシウムやほかの金属イオンと結合します。

1か所だけで結合する物質と違い、EDTA は6か所で金属を囲みます。そのため、できた錯体から金属が外れにくくなります。このように、1つの分子が複数の部位で金属を挟み込むことをキレートと呼び、6か所で結合する EDTA は六座のキレート剤です。Bothwell らは、EDTA が周期表のほとんどの金属と結合しうるとしています。

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注意したいのは、EDTA が外したい金属だけと結合するのではないことです。その場にあるほかの金属とも結合するので、どの用途でも「何を止めて、何を止めたくないか」を先に考えます。

日本薬局方国または地域の公的機関が定める医薬品の規格・試験法・品質基準を収載した公定書。詳しく →には、エデト酸ナトリウム水和物とエデト酸カルシウムナトリウム水和物が医薬品として収載されています。どちらも同じ EDTA の塩で、結合している金属の種類が違います。

2. 製剤にEDTAを入れれば、金属による酸化は防げるのか

防げることもありますが、金属の種類と、金属に対する EDTA の量によっては効かず、かえって酸化を進めることもあります。

Brovč らによると、タンパク質の製剤に微量の鉄や銅が混じると、活性酸素から反応性の高いヒドロキシルラジカルができる反応が進みやすくなります。そのため、酸化による変化が見つかったときにキレート剤を処方に加えることは、バイオ医薬品抗体や組換えタンパク質など、生きた細胞や微生物に作らせる医薬品の総称です。細胞治療・遺伝子治療の製品を含めて呼ぶこともあります。化学合成で作る核酸医薬やペプチドは、ふつう含めません。詳しく →の業界でよく行われています。

効いた例として、Zhou らは、鉄を加えた IgG2 抗体の溶液で、エデト酸二ナトリウムが酸化や凝集体タンパク質分子どうしが結合してできた高分子量の集合体です。有効性や免疫原性に影響するため、その含量を測ります。詳しく →の増加を抑えたと報告しています。ただし抑えられたのは、混じった鉄と化学量論的に結合できる量のキレート剤があるときで、それより少ない量では、鉄による分解を止められませんでした。

一方、Brovč らは、鉄とアスコルビン酸の系で EDTA を加えると、ヒドロキシルラジカルの生成がかえって速まり、タンパク質の酸化も進んだと報告しています。銅に置き換えた系では、EDTA を加えると生成はほぼ止まりました。

⁠同じ EDTA でも、相手が鉄か銅かで、酸化を止めることも進めることもあります。 Brovč らは、製剤ごとに条件が違うため、EDTA を加える根拠は慣習ではなく実験のデータに置くべきだと結論しています。添加剤の決め方の全体は、安定化剤・賦形剤の記事で説明しています。

3. 細胞の剥離・採血管・分析では、EDTAは何を外しているのか

細胞の剥離と採血管ではカルシウムを外し、分析では金属イオンと決まった比で結合する性質を使っています。

• 細胞の剥離⁠：細胞どうしの接着を担うカドヘリンは、カルシウムに依存して働く接着タンパク質です。EDTA でカルシウムを外すと接着が緩むため、酵素を使わずに細胞を剥離できます。メーカーは、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に 0.48 mM の EDTA を溶かした液を、酵素を使わない細胞の剥離液として販売しています。
• 採血管の抗凝固⁠：血液の凝固は、カルシウムを要する酵素の反応が連なって進みます。Banfi らによると、EDTA でカルシウムを外すと採血管の中での凝固は戻らない形で止まり、血球の形もよく保たれるため、血液学的検査の抗凝固剤として勧められてきました。
• 分析（キレート滴定）：EDTA が金属イオンと決まった比で結合することを使い、金属の量を滴定で求めます。日本薬局方は、0.05 mol/L のエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム液 1 mL が亜鉛 3.269 mg に相当すると定めています。

酵素で剥離する方法と比べると、EDTA だけの剥離は、酵素を止める操作が要らない点が違います。Beers らは、ヒトの多能性幹細胞さまざまな細胞へ分化できる能力を持つ幹細胞。オルガノイドなどの出発材料になる。詳しく →を EDTA で剥離して継代する手順を、酵素の中和も遠心も薬剤の処理も要らない方法として報告しています。iPS細胞体細胞を初期化して作る多能性幹細胞。同一株から繰り返し分化・製造でき均質性を高めやすい。詳しく →での手順は、iPS細胞の継代の記事で説明しています。

4. EDTAが入ると困るのは、どんなときか

残したい金属や、測りたい金属まで EDTA が外してしまうときに困ります。

ある工程で役に立った EDTA も、次の工程や検査に持ち込まれると、そこで要る金属を外します。実験と製造でよく出会うのは、次の3つです。

• 血液検査の値⁠：Sharratt らは、カリウム塩の EDTA が血清の検体に混じると、カリウムが高く、カルシウムやマグネシウムが低く出ると報告しています。微量の混入は気づかれにくく、著者らは採血管の順番を守ることを対策に挙げています。
• ニッケルのカラム⁠：His タグのタンパク質を精製する Ni-NTA のレジンクロマトグラフィーで目的物や不純物を結合させる粒子状の充填材。精製モードごとに使い分ける。詳しく →について、メーカーは EDTA がニッケルイオンをはがすとし、1 mM までなら使えた例もあるが注意が要るとしています。
• 微生物の試験⁠：日本薬局方の微生物限度試験法は、試料の抗菌作用を打ち消す中和剤の表に、EDTA（エデト酸塩）に対してマグネシウムかカルシウムのイオンを挙げています。EDTA を含む試料は、菌の発育を抑えて結果を低く見せるおそれがあるためです。

金属を要する酵素も、同じ理由で止まります。たとえば多くの非特異的なヌクレアーゼ核酸を分解する酵素です。製造では培養由来の残存DNA/RNAを分解・除去して製品の純度を高める目的で使い、ベンゾナーゼが代表例です。詳しく →はマグネシウムイオンがないと働かないため、前の工程の液に EDTA が残っていると、酵素を加えても反応が進みません。詳しくはエンドヌクレアーゼ処理の記事で説明しています。

5. EDTAを使う前に、何を確かめるのか

最初に、外したい金属と、外したくない金属を書き出します。

EDTA の働きは、金属を外すことに尽きます。効くかどうかも、困るかどうかも、その場にどの金属がどれだけあるかで決まります。使う前に、次の3つを確かめておきます。

• 外したい金属は何か⁠：製剤なら混じりうる鉄や銅、細胞の剥離や採血管ならカルシウムのように、止めたい働きとその金属を対応させます。
• 外したくない金属は何か⁠：次の工程の酵素のマグネシウム、精製カラムのニッケル、測りたい検査項目のカルシウムなど、残したい金属が同じ液や後の工程にないかを確かめます。
• 量は足りているか、後で除けるか⁠：製剤では、混じりうる金属と化学量論的に結合できる量かを確かめます。後の工程に持ち込みたくないときは、洗浄やバッファ交換で除く手順を決めておきます。

EDTA（エチレンジアミン四酢酸）を入れるかどうかは、外したい金属と残したい金属の両方を書き出してから決めます。 製剤では効き目を実験のデータで確かめ、実験では次の工程に EDTA を持ち込まない手順まで決めておくと、別の所で結果が狂うのを防げます。

参考文献

• Banfi G, Salvagno GL, Lippi G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro生きた動物の体外で、試験管やシャーレなどを用いて細胞・組織・分子レベルで行う実験を指す用語。詳しく → anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 2007;45(5):565-576. PubMed 17484616（4つのカルボキシ基と2つのアミンによるキレート、カルシウムを外して凝固を止める仕組み、血液学的検査の抗凝固剤）
• Bothwell TH, MacPhail AP. The potential role of NaFeEDTA as an iron fortificant. Int J Vitam Nutr Res. 2004;74(6):421-434. PubMed 15743018（EDTA は六座のキレート剤で、周期表のほとんどの金属と結合しうる）
• Zhou S, Zhang B, Sturm E, et al. Comparative evaluation of disodium edetate and diethylenetriaminepentaacetic acid as iron chelators to prevent metal-catalyzed destabilization of a therapeutic monoclonal antibody. J Pharm Sci. 2010;99(10):4239-4250. PubMed 20737631（鉄を加えた IgG2 抗体で、化学量論的な量のキレート剤が分解を抑えた）
• Brovč EV, Pajk S, Šink R, Mravljak J. Protein Formulations Containing Polysorbates: Are Metal Chelators Needed at All? Antioxidants. 2020;9(5):441. PMC7278585（鉄とアスコルビン酸の系で EDTA がヒドロキシルラジカルの生成を速めた、銅の系では止めた）
• Sivasankar S, Xie B. Engineering the Interactions of Classical Cadherin Cell-Cell Adhesion Proteins. J Immunol. 2023;211(3):343-349. PubMed 37459190（古典的カドヘリンはカルシウム依存の細胞間接着タンパク質）
• Beers J, Gulbranson DR, George N, et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 2012;7(11):2029-2040. PubMed 23099485（EDTA による酵素を使わない継代増殖した細胞を定期的に希釈・移植して培養を維持する操作で、回数が増えると細胞の性質が変化するリスクがある。詳しく →）
• Sharratt CL, Gilbert CJ, Cornes MC, Ford C, Gama R. EDTA sample contamination is common and often undetected, putting patients at unnecessary risk of harm. Int J Clin Pract. 2009;63(8):1259-1262. PubMed 19624792（カリウム塩の EDTA の混入による見かけの高カリウム・低カルシウム・低マグネシウム）
• 厚生労働省, 第十九改正日本薬局方（PMDA 掲載。医薬品各条 エデト酸ナトリウム水和物・エデト酸カルシウムナトリウム水和物、4.05 微生物限度試験法の表4.05-Ⅰ-2、容量分析用標準液 0.05 mol/L エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム液）
• Thermo Fisher Scientific, Versene Solution（PBS に 0.48 mM の EDTA を溶かした、酵素を使わない細胞の剥離液。メーカーの資料）
• ECA Academy, EMA Q&A: When is Testing for Endotoxin Masking Effects necessary for biological Products?（EMA の Q&A を引用。界面活性剤タンパク質の凝集や容器壁への吸着を防ぐため製剤へ少量加える添加剤で、細胞培養で細胞を保護する目的でも使われます。詳しく →とキレート剤（EDTA など）を組み合わせた処方では LER の試験結果を申請に含めるべきとする）
• QIAGEN, FAQ: reagents compatible with Ni-NTA（EDTA・EGTA はニッケルイオンをはがす。1 mM まで使えた例もあるが注意が要る。メーカーの資料）