共通基礎知識・分析

HPLCのピークが割れる・ずれるのはなぜ？原因を絞る順番と確かめ方

Proglenth 編集部公開 2026-10-01約7分で読めます

標準溶液を流したら、いつも1本で出るピークが2つに割れていた。あるいは保持時間が昨日と揃わず、手順書の基準から外れた。そういう朝に、カラムを新品に替える前に確かめられることが、いくつもあります。割れたピークは積分の仕方で面積が変わり、純度や含量がぶれます。

逆相HPLCカラム#RP-HPLC#品質管理#純度#含量

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核心は、症状が「どのピークに出たか」で原因の場所が分かれることです。前のほうに出るピークだけが割れるなら、試料を溶かした溶媒が移動相より強い場合が典型で、装置やカラムの不良ではなく、溶かし方の問題です。全部のピークが割れるなら、カラムの入口や接続を見ます。保持時間のずれも、全部が同じ割合で動いたのか、ピークごとに違うのかで、送液と化学に分かれます。

分析を担当する若手にも、結果を受け取る品質管理にも、カラムを提案する営業にも、最初に見るところは同じです。割れたのかずれたのか、それがどのピークに出たのかを先に見てから手を動かせば、替えなくてよいカラムを替えずに済みます。

前のほうのピークの割れ ― 試料の溶媒が強いとき

前のほうのピークが割れる典型的な原因は、試料を溶かした溶媒です。Shimadzu の資料は、前に出るピークだけが割れるなら、まずこれを疑うとしています。

ピークの割れと保持時間のずれを、どのピークに出たかで切り分ける模式図。上の段は割れ。左は前のほうのピークだけが割れる図で、試料を溶かした溶媒が移動相より強いのが原因で、試料の溶媒と注入量を疑う。右は全部のピークが割れる図で、入口のフリットの詰まり、充填剤の空洞、接続のすき間が原因で、カラムの入口と接続を見る。下の段は保持時間のずれ。左はピークごとに違う図で、昨日（点線）と今日（実線）を重ねると、動いたピークと動かないピークがある。動いたのは引き留められる強さ（化学の側）で、有機溶媒の割合、pH、温度を疑う。右は全部が同じ割合で動く図で、動いたのは液の流れる速さで、t0 も一緒に動く。ポンプの気泡、接続のにじみ、圧力の揺れを疑う。目盛りも数値も付けていない。 — ピークの割れとずれを、どのピークに出たかで切り分ける模式図

逆相HPLCでは、水に有機溶媒を混ぜた移動相の中で、成分が充填剤に引き留められます。試料が移動相より有機溶媒の多い液に溶けていると、注入された液の塊の中心では、成分が強い溶媒に囲まれたまま速く進みます。縁の分子は移動相に薄められて普通に保持されるので、同じ成分が速い群れと遅い群れに分かれます。保持の弱い成分は、塊が薄まる前にカラムを出てしまうため、前のほうから割れます。

Waters の例では、内径2.1 mm、長さ50 mmのカラムに、アセトニトリル5%から95%へのグラジエントをかけ、0.2 µg/mLの6成分を測りました。2 µL（カラム容積の約1.1%）は問題なく、4 µLに増やすと、前の2本だけが高くならず、幅が広がって前に張り出しました。溶媒がアセトニトリル50%だったためです。10%に溶かし直した4 µLでは、全部のピークが2 µLの約2倍の高さで、形も整いました。崩れ方は割れではなく前への張り出し（フロンティング）でしたが、差が大きければ同じ仕組みで割れます。

前のほうのピークだけが崩れたら、カラムや装置より先に、試料の溶媒と注入量を疑います。

溶媒と注入量の兼ね合い ― 15%の目安と薄め方

量が少なければ、強い溶媒でも崩れは小さくなります。

LCGC の解説が挙げる目安は、溶媒が移動相と同じとき、注入量を最初に見たいピークの体積の15%未満にすることです。ピーク体積は、底の幅に流量をかけて求めます。Waters の例の「カラム容積の1〜10%」という目安にも、試料の溶媒の強さを開始時の移動相と比べて考えるよう添えられています。目安の範囲内の4 µLでも、溶媒が強ければ崩れました。

直し方は、効き目の大きい順に3つです。最も確実なのは、開始条件の移動相で試料を溶かすことで、Shimadzu の資料も、希釈液を開始条件の移動相に合わせるよう勧めています。難しければ有機溶媒を減らして水を増やしますが、疎水性の高い成分は溶けにくくなります。注入量を減らすのは最後の手です。不純物のピークが小さくなり、定量限界に近づきます。

装置側にも手があり、Shimadzu の Nexera には、試料と一緒に水のような弱い溶媒を吸って混ぜる共注入（co-injection）の機能があります。同社のアプリケーションノートは、HPLC向けの条件をUHPLC（超高速液体クロマトグラフ）装置でそのまま使うと、試料の溶媒が強いときにピークが広がりやすいとし、共注入で理論段数が高まった例を示しています。装置を更新した直後に割れが出たら、不具合の前に、試料の溶媒との相性を疑います。

試料の溶媒は開始条件の移動相に近いほど安全で、離れるほど、注入量を絞るか装置側で薄める必要があります。

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全部のピークの割れ ― カラムの入口と接続

全部が割れるなら、原因は試料の手前にあります。Phenomenex の資料は、割れが1本か全部かを最初の手がかりとしています。

入口のフリット（カラムの端で充填剤を押さえる焼結フィルター）が部分的に詰まると、試料の一部が遅れて入ります。充填剤に空洞ができても、一部の試料が先に進みます。注入器からカラム、検出器までの接続のすき間も原因です。

切り分けは圧力から始めます。カラムを外した状態と付けた状態で圧力を比べ、詰まりがカラムの外にないかを見ます。カラムが疑わしければ、メーカーが許す場合に限り、逆向きにつなぎ、流量を下げて強い溶媒を流す逆流洗浄（reverse flush）を試します。圧力が戻らなければ交換です。

全部のピークが割れたら、溶媒の調整より先に、カラムの入口と接続を見ます。

保持時間のずれ ― 全部が同じ割合か、ピークごとか

ずれも、全部のピークが同じ割合で動いたのか、ピークごとに違うのかで、疑う場所が決まります。

全部が同じ割合で動いたなら、動いたのは液の流れる速さです。カラムに保持されずに素通りする成分の出る時間（t0）も、一緒に動きます。ポンプの気泡、チェックバルブやシールの傷み、接続のにじみを疑い、圧力の揺れを手がかりにします。

ピークごとに違うなら、動いたのは成分が引き留められる強さ、つまり化学の側です。いちばん効くのは有機溶媒の割合です。Dolan は、等組成の逆相で有機溶媒が1ポイント違うと、保持係数（retention factor、k）が、分子量500ほどの試料で10〜15%動くと整理しています。10ポイント違えば約3倍とする経験則もあり、分子量1,000未満の目安です。計量の誤りや、ボトルからの有機溶媒の蒸発でも、組成は動きます。

酸や塩基の性質を持つ成分は、pKa（半分がイオン化するpH）の近くで、pHが少し動くだけで保持が大きく動きます。温度も、逆相では上がるほど保持が短くなります。試料の溶媒が強いときも、ピークは広がり、保持時間は短くなります（LCGC の解説）。耐えるずれの幅は、開発で決めておく内容です（分析法の頑健性）。

全部が同じ割合なら流れ、ピークごとなら化学と分けるだけで、見る場所は半分に減ります。

広がりとテーリング ― 割れ・ずれとは別の原因

太るのは、カラム外の流路の容積が増えたときで、配管の内径と長さ、継手のすき間が主な場所です（デッドボリューム）。尾を引くのは、ペプチドやタンパク質がカラム表面のシラノール基に引っかかる例が多く、加える酸の種類で変わります（移動相に加える酸）。

システム適合性が拾える範囲 ― 標準溶液に映らない崩れ

システム適合性（system suitability）は、標準溶液を流して、その日の装置とカラムで測れるかを確かめる試験です（システム適合性）。標準溶液に出ない崩れには気づけません。標準を移動相に近い液で作り、試料は抽出に使った有機溶媒の多い液のまま注入すれば、標準は鋭く出て合格し、試料のピークだけが割れます。

POINT

割れの原因が試料の溶媒と分かったら、標準溶液と試料溶液の溶媒の強さを手順書でそろえます。

USP 〈621〉は、2022年12月1日に調和版が公式になりました。別の指定がなければ、システム適合性を満たすことを条件に、移動相のpHは±0.2、緩衝塩の濃度は±10%まで調整できます。幅の中でずれを戻すのは正当な手順ですが、原因が漏れや調製の誤りなら、直すべきは原因です。

確かめる順番 ― 費用の小さいものから

順番は、費用の小さい順です。カラムの交換は最も高く、原因の手がかりも消えます。だから最後に回します。

カラムを替える前に、費用の小さい順に確かめる手順の概念図。上から下へ5段で、左の縦の矢印が費用の小さいものから最も高いものへの向きを示す。1段目は記録と波形で、割れたのは全部か前のほうだけか、ずれたのは同じ割合かピークごとか、t0と圧力は動いたか、合格した最後の日から移動相のロット、試料の溶媒、配管、カラムのどれが変わったかを見る。2段目は注入量で、半分にして3〜5回流し、形が良くなれば試料の溶媒が原因、変わらなければ別の原因として次へ進む。3段目は移動相で、作り直し、有機溶媒の計量、pH、使用期限を確かめ、接続のにじみ、圧力の揺れ、ポンプの気泡、カラムオーブンの温度も見る。戻らなければ次へ。4段目はカラムの手前で、ガードカラムを外し、カラムを外した圧力を測り、メーカーが許すなら逆流洗浄をする。形も圧力も戻らないときに、はじめて5段目のカラムの交換へ進む。カラムの交換は最も高く、原因の手がかりも消えるので最後に回す。 — カラムを替える前に、費用の小さい順に確かめる手順の概念図

先に、記録と波形を見ます。割れたのは全部か前のほうだけか、ずれたのは同じ割合かピークごとか、t0と圧力は動いたか。合格した最後の日から、移動相のロット、試料の溶媒、配管、カラムのどれが変わったかも洗い出します。

次に、注入量を半分にして3〜5回流します（Shimadzu の資料）。形が良くなれば試料の溶媒が原因で、変わらなければ別の原因です。

そのうえで、移動相を作り直し、有機溶媒の計量、pH、使用期限を確かめます。接続のにじみ、圧力の揺れ、ポンプの気泡、カラムオーブンの温度も見ます。戻らなければ、ガードカラムを外し、カラムを外した圧力を測り、メーカーが許すなら逆流洗浄をします。形も圧力も戻らないときに、はじめてカラムを交換します。条件を動かすなら、〈621〉の許す幅か変更管理かを先に決めます。

カラムが疑わしいときは、説明書で逆流洗浄の可否と使えるpHの範囲を確かめます。選び直しは逆相HPLCカラムで比べます。

カラムを替える前に、記録、注入量、移動相、カラムの手前の順で確かめます。