プラスミドDNA（pDNA）の製造工程とは？発酵からスーパーコイル精製まで

pDNAは大腸菌のプラスミドを大量培養し、菌体から回収・精製して得ます。工程の考え方は組換えタンパク質の発酵と共通する部分が多い一方で、目的物が「タンパク質」ではなく「環状DNA」であることが、品質管理の勘所を大きく変えます。核心にあるのは、負に強くねじれた閉環状二本鎖、すなわちスーパーコイル体（supercoiled、covalently closed circular）の比率をいかに高く保つか、という一点です。片方の鎖にニックが入って弛緩したオープンサーキュラー体（OC体）や、直鎖体、変性体、多量体は不純物として扱われ、トランスフェクション培養細胞に外来の核酸を導入する操作。ウイルスベクターの一過性の産生などに用いられる。効率やIVT鋳型試験管内転写でmRNAを合成する際に用いる元となるDNA分子のこと。としての性能に効いてきます。

本稿では、宿主株の選択から、スーパーコイル体を保つ培養設計、アルカリ溶菌と清澄化、RNA・ゲノムDNA・エンドトキシン・OC体を落とすクロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。、そしてスーパーコイルプラスミドDNAのうち、しっかりねじれた高品質な形態(スーパーコイル)が占める割合です。原料の品質を示す指標です。詳しく →%やエンドトキシングラム陰性菌の外膜由来の発熱性物質（LPS）で、注射剤では厳しく管理し、LAL試験などで測定します。詳しく →といった規格までを、順を追って整理します。

pDNAの用途拡大とグレードの考え方

かつてpDNAの品質要求は「配列が正しく、そこそこ純度製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →が高ければよい」という水準で足りていました。しかし用途が医薬品の側へ移るにつれ、要求は一段厳しくなっています。

ウイルスベクター製造では、AAVのトリプルトランスフェクションAAV製造で、必要な3種類のプラスミドを同時に細胞へ導入してベクターを作らせる手法です。ウイルスを使わず遺伝子だけで産生します。詳しく →やレンチウイルスの複数プラスミド系で、pDNAは細胞に導入される出発原料そのものです。スーパーコイル体の比率が下がるとトランスフェクション効率が落ち、ベクター収量やベクター品質に波及します。mRNA医薬では、目的遺伝子の下流を制限酵素で切って直鎖化し、これを鋳型にT7 RNAポリメラーゼ試験管内転写(IVT)でmRNAを合成するために使う酵素や試薬類です。T7 RNAポリメラーゼやNTP、鋳型を分解するDNaseなどが含まれます。詳しく →で転写します。ここでも鋳型プラスミド大腸菌の中で複製・増幅させる環状DNA。核酸医薬やベクター製造の伝統的な出発材料。の純度と均一性が、直鎖化環状のプラスミドを制限酵素で1か所切り、直鎖にすること。の効率と転写産物の質を左右します。DNAワクチンではpDNAが原薬（ドラッグサブスタンス）そのものであり、注射剤として無菌性やエンドトキシンにも厳格な管理が求められます。

こうした違いから、pDNAは大きく「リサーチグレード（研究用）」と「GMPグレード医薬品の製造品質管理基準（GMP）に適合した製造管理と品質試験のもとで製造・出荷された試薬・原料の品質区分。」に分かれます。前者は探索・前臨床の材料に用いられ、後者は臨床・商用の医薬品出発原料や原薬として、GMP医薬品を一定の品質で安全に造るために守るべき製造・品質管理の基準（適正製造規範）です。詳しく →下で製造され、規格・トレーサビリティ・無菌管理まで作り込まれます。⁠同じ配列のプラスミドでも、どのグレードで供給するかによって工程設計と管理の厚みがまるで変わります。

宿主株の選択 ― endA/recA欠損が効く理由

pDNA製造の宿主には、DH5αに代表される大腸菌の実験室株がよく使われます。ここで重要になるのが、遺伝的背景、とくに endA と recA という2つの変異です。

endA1 変異は、ペリプラズムに存在する非特異的なエンドヌクレアーゼ核酸を分解する酵素です。製造では培養由来の残存DNA/RNAを分解・除去して製品の純度を高める目的で使い、ベンゾナーゼが代表例です。詳しく →I（endA遺伝子産物）を機能欠損させます。この酵素が残っていると、精製の過程でプラスミドにニックが入り、せっかくのスーパーコイル体がOC体へと変わってしまいます。endA欠損株を使うことで、この背景ニックを抑え、スーパーコイル体の比率と収量を保ちやすくなります。もう一方の recA 変異は相同組換えを担う RecA を欠損させ、プラスミド内の反復配列どうしの組換えを抑えます。これにより、多量体化や配列の欠失・再編成が起こりにくくなります。とくにAAVプラスミドの逆位末端反復（ITRAAVゲノムの両端にある逆位末端反復配列。複製とパッケージングのシグナルとして働き、この間の配列がカプシドに詰め込まれる。）のようなパリンドローム・反復構造は不安定で、組換え能の高い株では脱落しやすいため、組換え欠損の背景が構造の安定維持に寄与します。

プラスミドの骨格側では、複製起点（ori）が振る舞いを決めます。pUC系のような高コピー型の ori を持たせると、菌体あたりのプラスミド量が増え、収量に有利です。宿主株はマスターセルバンク（MCB）／ワーキングセルバンク（WCB）MCBを解凍・拡大して作る、日常製造で取り崩す細胞在庫。製造のたびにここから始めます。の二層で凍結保存し、ロット間の再現性の出発点をそろえます。この菌株準備とセルバンクの考え方は、組換えタンパク質遺伝子組換えで微生物や細胞に作らせた目的タンパク質。宿主により折りたたみやコスト、糖鎖が異なる。と共通で、微生物発酵（大腸菌）の製造工程で整理した流れがそのまま土台になります。

もうひとつ骨格設計で見落とせないのが、培養中にプラスミドを保持させるための選択マーカーです。研究用途では抗生物質耐性遺伝子特定の抗生物質に対する抵抗性を細胞に付与する遺伝子で、プラスミドの選択マーカーとして利用されるが残留が懸念される。（アンピシリン目的の遺伝子(耐性マーカー)を持つ細胞だけを生き残らせるために培地へ加える抗生物質です。詳しく →など）で選択するのが手軽ですが、医薬品用のpDNAでは、耐性遺伝子や抗生物質が最終製品や環境に残ることを避ける観点から、これらを骨格から外す設計が望まれます。ベータラクタム系耐性遺伝子はとくに敬遠され、代替として、栄養要求性を相補する系や、抑制因子とオペレーターを用いた抗生物質フリーの選択系が検討されます。搭載遺伝子側の配列設計（コドン最適化アミノ酸配列を変えずにDNAのコドンの並べ方だけを組み替え、発現量を高める設計操作。など）は最終製品の発現目的タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で転写・翻訳させ、機能的なタンパク質として産生させる工程。性能に関わる別の論点ですが、骨格の選択マーカーは製造の管理と規制対応に直結するため、開発の早い段階で方針を固めておくことが実務的です。

スーパーコイル体を保つ培養設計 ― 温度・増殖速度・コピー数

発酵の目的は、プラスミドを高いコピー数で、かつスーパーコイル体の割合を高く保ったまま、多くの菌体に蓄えさせることです。ここには収量と品質のトレードオフがあります。

高密度の流加（フェドバッチ種培養で増やした細胞を大型の培養槽に移し、目的物質を本格的に産生させる最終段階の培養です。栄養を追加しながら育てるフェドバッチが広く使われます。詳しく →）培養が基本になります。炭素源を最初に大量投入すると過剰代謝で酢酸が蓄積し、増殖もプラスミドの維持も阻害するため、炭素源を制御しながら供給して高細胞密度まで増やします。このフィードフェドバッチで追い足す濃縮した栄養液。いつ・どれだけ・どう入れるかが生産性と品質を左右する。制御の考え方は発酵培地とフィード設計と共通です。増殖速度も重要な操作因子で、一般に高すぎる比増殖速度細胞集団が増える速さの指標。高浸透圧で大きく低下し、比生産性とトレードオフになる。は菌体あたりのプラスミド含量製品にどれだけの目的物質が含まれるか（含量）や、その生物学的な効き目の強さ（活性）を示す指標です。培養液中の産生量を指す場合もあります。詳しく →や品質を下げる傾向があり、緩やかで安定した増殖のほうがスーパーコイル体を保ちやすいとされます。

温度は二重の意味を持ちます。pUC系の一部の ori は温度感受性で、培養後半に温度を上げるとコピー数が増幅されることが知られ、収量を伸ばす操作として使われます。一方で、プラスミドの負のねじれ（負スーパーコイル）はDNAジャイレースとトポイソメラーゼのバランスによって菌体内で維持されており、これは細胞のエネルギー状態に依存します。定常期に深く入りすぎたり、菌体にストレスがかかったりすると、スーパーコイルが緩んでOC体へ移りやすくなります。

これらの因子は、収量と品質でしばしば逆を向きます。高コピー型の ori や培養後半の昇温は収量を押し上げますが、宿主への負荷やねじれ維持とのバランスを崩すと品質が振れます。比増殖速度は速いほど短時間で増える反面、緩やかなほうが菌体あたりの含量とスーパーコイル品質を保ちやすい傾向があります。収穫を遅らせれば菌体量は増えますが、定常期を深追いするほどOC体化が進みます。⁠そのため「限界まで濃く・長く育てる」ことがそのまま良品につながるとは限らず、コピー数の増幅と品質維持がちょうど両立する収穫タイミングを見極めることが、pDNA発酵の要になります。

アルカリ溶菌と清澄化

菌体を集めたあと、pDNAを取り出す第一歩がアルカリ溶菌です。これはpDNA製造にほぼ固有の、そして最も繊細な工程です。

まず菌体を懸濁し、水酸化ナトリウムとSDSを含むアルカリ溶液を加えます。アルカリでゲノムDNA（gDNA）とタンパク質が変性し、SDSが膜を溶かして細胞を壊します。このとき、大きなgDNAは二本鎖が完全に離れて変性しますが、閉環状のプラスミドは二本の鎖がトポロジーDNAの鎖のつながり方や立体的な形状（環状・直鎖・超らせんなど）を表す概念で、核酸の性質や挙動に影響する。的に絡み合ったままなので離れきりません。続いて酢酸カリウムなどの酸性溶液で中和低pH条件で溶出されたサンプルに緩衝液を加えてpHを中性付近に戻し、製品へのダメージを防ぐ操作。すると、変性したgDNAやタンパク質、SDSは巨大な沈殿（フロック）を形成して落ち、プラスミドだけが正しく再生（リネイチャー）して可溶のまま残ります。

難しさは、アルカリへの曝露を「ちょうどよく」保つ点にあります。強すぎる、あるいは長すぎるアルカリ処理は、プラスミドを不可逆に変性させ、中和しても元に戻らない変性スーパーコイル体やOC体を生みます。逆に混合が乱暴だと、変性した長大なgDNAが剪断されて細かい断片になり、これがプラスミドと物性が近くなって後段で分離しにくくなります。つまり均一で、かつ穏やかな混合が必須で、これは製造スケールに上げるほど難しくなります。実験室のピペット操作では容易でも、数百リットル規模で「速く均一に、しかし穏やかに」混ぜる設計そのものが技術課題です。

中和後は清澄化で沈殿を除きます。SDS-カリウム塩の沈殿は浮きやすい性質を利用した浮上分離や、デプスフィルターによるろ過、遠心分離を組み合わせ、澄んだライセートを得ます。⁠アルカリ溶菌はスーパーコイル体の運命が最初に決まる工程であり、pH・時間・混合の作り込みが、以降の精製で取り返せない品質差を生みます。

クロマトグラフィーによる不純物除去

清澄化したライセートには、目的のプラスミド以外に大量のRNA、断片化したgDNA、宿主タンパク質、そしてエンドトキシンが含まれます。これらを段階的に落とし、あわせてスーパーコイル体とOC体・変性体を分けていくのがクロマトグラフィーの役割です。

クロマトの前に、選択的沈殿で負荷を下げることがよく行われます。RNAは量が多いため、かつてはRNaseで分解する方法が一般的でしたが、GMPでは動物由来成分を避ける観点から、RNase非依存の設計が好まれます。塩化カルシウムやイソプロパノール、硫酸アンモニウム、PEGなどによる選択沈殿でRNAやgDNAを先に減らす手法が用いられます。

そのうえで、原理の異なるクロマトを組み合わせます。DNAは強く負に帯電しているため、陰イオン交換（AEX）がキャプチャーの中心になります。電荷密度の違いで、RNAやgDNA、そしてスーパーコイル体とOC体をある程度分離できます。ただしエンドトキシンも負に帯電しているためAEXだけでは分けきれず、疎水性相互作用（HIC）を組み合わせます。HICは一本鎖・変性DNAやエンドトキシン、OC体がスーパーコイル体より疎水的である差を使い、これらを引き離すのに有効です。仕上げには分子サイズで分けるサイズ排除（SEC）を置き、巨大なgDNAや小さなRNA・エンドトキシンを除きつつ、最終バッファへ置換します。

原理の異なる工程を重ねる考え方や、レジンの選定・除去能の評価は、タンパク質の精製と共通する部分が多く、微生物ダウンストリーム精製の整理が参考になります。とりわけ電荷が近く分けにくいエンドトキシンの除去は、専用担体や運転条件の作り込みが要点で、微生物のエンドトキシン除去で詳しく扱っています。⁠電荷で分けるAEXと疎水性で分けるHICを軸に、SECで仕上げる多段設計が、pDNA精製の定石です。

規格と品質管理 ― スーパーコイル%・残存不純物・エンドトキシン

pDNAの品質は複数の軸で規定されます。中心はやはりスーパーコイル体の比率です。OC体・直鎖体・多量体・変性体との相対割合として、アガロースゲル電気泳動やAEX-HPLC、キャピラリーゲル電気泳動で測定され、高純度グレードでは大部分をスーパーコイル体が占めることが求められます。具体的な合格値はグレードや用途、各社の規格で幅があるため、断定は避け、一次情報での確認が前提になります。

残存不純物としては、宿主由来のgDNA、RNA、タンパク質（HCP）の残存量を管理します。gDNAは定量PCRなどで、RNAやタンパク質はそれぞれの分析で評価し、各クロマト工程の除去能を数値で裏づけます。同一性は制限酵素消化パターンや配列解析で確認し、含量はUV吸収（A260）で測ります。純度の目安としてA260/A280比も併用されます。

そして注射用途で決定的に重要なのがエンドトキシン（リポ多糖、LPS）です。グラム陰性菌である大腸菌に由来し、強い発熱性を持つため、DNAワクチンのように直接投与するpDNAでは極めて低いレベルまで下げる必要があります。管理はLAL試験や組換え試薬（rFC）による方法で行い、ロットごとに規格適合を確認します。あわせて、GMPグレードではバイオバーデン・無菌性の管理も規格に組み込まれます。⁠pDNAの規格は「スーパーコイル%という均一性」「gDNA/RNA/HCPという残存不純物」「エンドトキシンという安全性」の三本柱で構成され、用途とグレードに応じて要求水準が決まります。

まとめ

pDNAの発酵製造は、大腸菌を高密度に育ててプラスミドを蓄えさせる前半と、菌体を穏やかに溶かして環状DNAを取り出し不純物を段階的に除く後半で成り立っています。組換えタンパク質の工程と骨格は共通しますが、目的物が環状DNAであるがゆえに、スーパーコイル体をいかに壊さず保つかという固有の課題が全工程を貫きます。endA/recA欠損株の選択、増殖速度・温度・コピー数を織り込んだ培養設計、pHと混合を作り込むアルカリ溶菌、電荷と疎水性を組み合わせたクロマト、そしてスーパーコイル%・残存不純物・エンドトキシンの規格管理が、一本の線でつながっています。AAV/レンチの原料、mRNAのIVT鋳型、DNAワクチンと用途が広がるなか、求められるグレードと規格を起点に工程を逆算する視点が、実務では欠かせません。

参考文献

• ICH Q6B「生物薬品（バイオテクノロジー応用医薬品／生物起源由来医薬品）の規格及び試験方法の設定」― 規格・試験項目の設定の考え方
• ICH Q5A(R2)「バイオテクノロジー応用医薬品のウイルス安全性評価」― 宿主・原材料管理およびウイルスベクター出発原料の考え方
• USP <85> Bacterial Endotoxins Test／USP <1085> Guidelines on the Endotoxins Test ― エンドトキシン試験
• 日本薬局方 一般試験法「エンドトキシン試験法」および欧州薬局方 2.6.14 "Bacterial endotoxins"
• FDA Guidance for Industry "Considerations for Plasmid DNA Vaccines for Infectious Disease Indications" ― DNAワクチンの品質・製造の考え方
• WHO「Guidelines for assuring the quality and nonclinical safety evaluation of DNA vaccines」― DNAワクチン原薬の品質評価