クロマトグラフィーとは？付けて外すと目的の分子だけ取れる理由

培養液をカラムに流すと、出てくる液には目的の抗体がほとんど入っていません。抗体はレジンクロマトグラフィーで目的物や不純物を結合させる粒子状の充填材。精製モードごとに使い分ける。詳しく →に付いたまま残り、あとで液を替えたときに初めて出てきます。「カラムはふるいのように不純物をこし取っているのでは？」と思っていた人は、ここで戸惑うのではないでしょうか。

クロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。詳しく →とは、液を流しながら、分子がレジン（固定相）に付く強さの違いで混合物を分ける方法です。⁠精製で目的の分子だけを取り出せるのは、液の条件で「付く・付かない」を切り替え、目的の分子が付いている間に不純物を洗い流すからです。 裏を返せば、同じ力で付く不純物は一緒に残ります。

この記事では、付けて洗って外す流れ、何の力で付けるかの選び方、抗体の精製でカラムを何本も重ねる理由、不純物のほうを付けるフロースルークロマトグラフィーで担体に結合せずに流れ出る液（画分）、またはそれを使う運転方式です。目的物を素通りさせ、不純物だけを担体に結合させて除くときに使います。詳しく →という使い方を、精製の条件を組む人の目線で説明します。

1. レジンは不純物をこし取らず、付く分子を選んでいる

クロマトグラフィーでは、動かない相（固定相）と流れる相（移動相）のあいだで、分子が行き来します（日本薬局方 2.00）。精製では、固定相はカラムに詰めた粒状のレジン、移動相は緩衝液溶液のpHを一定範囲に保つために使用される弱酸と共役塩基の混合溶液。詳しく →です。

分子が分かれるのは、レジンに付いている時間の割合が分子ごとに違うからです。 付きやすい分子はカラムの中にとどまり、付きにくい分子は液と一緒に先へ流れます。

精製では、この違いを極端な形で使います。負荷のときは、目的の分子がほぼ動かないほど強く付く条件にします。外すときは、ほとんど付かない条件に切り替えます。こうしてオンとオフを液で切り替えるので、1回の運転は次の4つの手順で進みます（Cytiva の選び方の資料）。

1. 平衡化⁠：カラムを、目的の分子が付く液の条件（pH・塩濃度）にそろえる。
2. 負荷と洗浄⁠：試料を流して目的の分子を付け、付かなかったものを洗い流す。
3. 溶出⁠：液の組成を変えて、付いていた分子を外す。
4. 再生⁠：外れずに残った物を落とし、次の運転に備えます。

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付けて外す手順には、もう1つ効き目があります。大量の薄い培養液から付けた分子を、少ない液量でまとめて外すので、目的の分子は濃くなって出てきます。精製と濃縮を一度にこなしている形です。

ただし、図の赤い分子のように、同じ条件で付く不純物は溶出のときに一緒に出てきます。だから、何の力で付けるかを選ぶことが、精製の設計の中心にあります。

2. 何で付けるかは、親和性・電荷・疎水性・大きさから選ぶ

レジンに付く力は、分子のどの性質を使うかで4つに分かれ、どれを選ぶかで一緒に残る不純物が決まります。 分け方には、吸着・分配・イオン交換のほか、分子の大きさの違いを使うものがあります（日本薬局方国または地域の公的機関が定める医薬品の規格・試験法・品質基準を収載した公定書。詳しく → 2.00）。

電荷で付ける方式では、液のpHと、タンパク質の等電点抗体全体の正味電荷がゼロになるpH。電荷の性質を表す指標で、会合や粘度に関わる。詳しく →（pI、正味の電荷がゼロになるpH）の関係が効きます。目安はこうです。pIより低いpHではタンパク質は正に帯電して陽イオン交換体に付き、pIより高いpHでは負に帯電して陰イオン交換体に付きます（Cytiva の選び方の資料）。

では、付いた分子はなぜ塩で外れるのか。塩のイオンがレジンの電荷を奪い合い、タンパク質が付いていられなくなるからです。⁠同じレジンでも、液のpHと塩の濃さを変えれば、付く分子と付かない分子の顔ぶれが入れ替わります。

疎水性で付ける HIC分子表面の疎水性の違いを利用して分けるクロマト担体で、高い塩濃度で吸着させ塩を下げて溶出させます。抗体の凝集体除去などに使われます。詳しく → は逆で、塩を足すほど付きます。その仕組み、つまり塩がタンパク質とレジンを覆う水を奪って疎水面どうしを触れさせることは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）とは？で扱います。

3. 同じ力で付く不純物が残るので、違う力のカラムを重ねる

Protein A抗体に特異的に結合するProtein Aを担体に固定し、抗体だけを選択的に捕まえて精製する手法です。抗体医薬の最初の精製工程として定番になっています。詳しく → のように特定の部位をつかむ方式は、1回で高い純度まで上げられます。抗体の精製の多くが Protein A から始まるのは、この強みがあるからです（Liu HF, et al. 2010）。では、それで精製は終わりでしょうか。

1本では終わりません。⁠Protein A が見ているのは Fc 領域だけなので、Fc 領域を持つものは、抗体の凝集体タンパク質分子どうしが結合してできた高分子量の集合体です。有効性や免疫原性に影響するため、その含量を測ります。詳しく →（抗体どうしが集まった塊）でも一緒に付いて出てくるからです。 レジンから外れた Protein A そのもの（リーチング）も、溶出液に混ざります（Liu HF, et al. 2010）。

そこで、Protein A のあとに、電荷や疎水性のように別の性質で分けるカラムを置きます。プラットフォームと呼ばれる標準的な抗体の精製では、仕上げ（ポリッシング捕捉工程の後、電荷や疎水性の違いを使って残った副産物を削り純度を上げる磨き上げ精製。詳しく →）のクロマトグラフィーを1〜2本、多くは2本置きます（Liu HF, et al. 2010; Shukla AA, et al. 2007）。

ここで大事なのは、本数ではなく組み合わせです。前のカラムと同じ性質で分けるカラムを足しても、前で残った不純物は次でも同じように残ります。電荷で残った凝集体を疎水性で分ける、というように、違う力を重ねることで、1本では分けられなかったものが分かれます。CEX と AEX の分担は抗体精製のポリッシングとは？で説明しています。

4. 目的の分子を付けず、不純物のほうを付ける運転もある

ここまでは、目的の分子を付けて外す運転（バインドエリュート目的物を担体に結合させ、塩濃度やpHを変えて溶出させる運転様式。溶出の分画により凝集体などの不純物を分離・除去できる。詳しく →）でした。⁠逆に、目的の分子は付かない条件にして、不純物だけをレジンに残す運転があり、フロースルーと呼びます。

抗体の精製でよく使われるのが、陰イオン交換正に帯電した担体に負電荷の物質を吸着させて分離する手法。フロースルーでDNAやウイルスを除くのに使う。詳しく →のフロースルーです。pIの高い抗体は、pH 8前後では正味の負電荷がほとんどないので、陰イオン交換体に付かずに素通りします。一方、核酸や宿主細胞由来タンパク質（HCP）のように酸性の不純物は、負に帯電してレジンに付きます。

この運転は、HCP・DNA・外れた Protein A・ウイルスを除く目的で使われます。pIが7.5を超える抗体では、運転のpHは通常8〜8.2、導電率液のイオン強度の目安となる電気の通りやすさ。バッファ調製やクロマト制御で監視する。詳しく →は10 mS/cm までとした例が挙げられています（Liu HF, et al. 2010）。

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フロースルーでは、レジンが受け止めるのは量の少ない不純物だけです。そのため同じレジンの量で、より多くの目的の分子を流せます。

ただし、外す手順がないぶん、付き方の似た不純物を細かく分けることはできません。では、性質の近い不純物はどうするか。凝集体のように目的の分子と近いものは、付けて外す運転にして、外れる順番の差で分けます。どちらを選ぶかは、陽イオン交換のバインドエリュートとフロースルーは何で選ぶ？で扱いました。

5. 分析のHPLCは、付けて外すのではなく、流れの中の遅れで分ける

品質試験で使う高速液体クロマトグラフィー（HPLC）も、同じクロマトグラフィーです。ただし分け方の考え方が違います。⁠HPLC は、少量の試料を一定の液の流れに乗せ、成分ごとにカラムを通り抜けるまでの時間の差で分けます。

精製では、目的の分子をいったん止め、液を替えてまとめて外します。分析はそうしません。成分を止めずに流し続け、固定相に付いている時間の割合の差を、出てくるまでの時間（保持時間）の差として読み取ります。だから分析では、少しずつ遅れて出てくる山（ピーク）が並んだ図になり、その面積から量を読みます。その仕組みはHPLCとは？で扱います。

精製で目指すのは、目的の分子をたくさん、純度よく回収すること。分析で目指すのは、成分を見分けて、それぞれの量を正しく測ることです。同じ原理を、目的に合わせて使い分けています。

6. 自分の工程では、除きたい不純物から付ける力を決める

クロマトグラフィーの設計は、レジンの名前を選ぶところから始まりません。⁠最初に決めるのは、何を除きたいかと、目的の分子のどの性質がその不純物と違うかです。

ステップ1：前の工程のあとに、何が残っているかを測る

凝集体、HCP、DNA、外れた Protein A のうち、どれがどれだけ残っているかを数字で押さえます。

ステップ2：目的の分子と不純物で、違う性質を探す

pI（電荷）、疎水性、大きさのどれで差が出るかを見ます。前のカラムと同じ性質なら、そのカラムでは分かれません。

ステップ3：付けて外すか、素通りさせるかを決める

性質の近い不純物を分けるならバインドエリュート、量の少ない不純物を除いて処理量を取るならフロースルーです。

ステップ4：付く・付かないの条件を、小さなカラムで確かめる

pHと塩の濃さを振って、目的の分子と不純物がそれぞれ付くかどうかを確かめます。レジンの選び方は精製クロマトの担体（レジン）の選び方、レジンの種類を比べるならProtein Aレジンへ。

付く・付かないを液で切り替えるのがクロマトグラフィーで、どの力で付けるかを決めれば、一緒に残る不純物と次に置くカラムも見えてきます。

参考文献

• 厚生労働省, 第十九改正日本薬局方 通則〜一般試験法（2.00 クロマトグラフィー総論：固定相と移動相の2相への分配、吸着・分配・イオン交換・大きさによる分離。欧州薬局方欧州医薬品品質局（EDQM）が発行する、医薬品の品質基準を定めた公定書で、署名国・加盟国の規制に法的効力を持つ。詳しく →・米国薬局方米国で医薬品・原料・試験法の公式基準を定める公定書で、製薬用水に関する規格も収載されている。詳しく →と調和）
• Cytiva, Ion exchange chromatography columns and resins: Selection guide（CY12727、2020年。平衡化・負荷と洗浄・溶出・再生の4つの手順、目的の分子が付く条件で負荷して条件を変えて外すこと、pIより高いpHでは陰イオン交換体に、低いpHでは陽イオン交換体に付くこと）
• Liu HF, Ma J, Winter C, Bayer R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. mAbs. 2010;2(5):480-499.（Protein AはIgGのFc領域に結合し、pH 6〜8で負荷、pH 2.5〜4で溶出。Protein Aのリーチング。CEXは導電率かpHを上げて溶出。pIが7.5を超える抗体ではAEXのフロースルーが適し、HCP・DNA・外れたProtein A・ウイルスを除く。運転のpHは通常8〜8.2、導電率は10 mS/cmまで。ポリッシングは1〜2本、標準的には2本）
• Shukla AA, Hubbard B, Tressel T, Guhan S, Low D. Downstream processing of monoclonal antibodies: Application of platform approaches. J Chromatogr B. 2007;848(1):28-39.（Protein Aによる捕捉のあとに1〜2のポリッシング工程を置くプラットフォームの考え方）