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細胞治療（iPS細胞）の工程チェックリスト

検討する工程に印を付けて、規模と用途を書けば、仕様メモにして代理店やメーカーへ渡せます。工程ごとの詳しい説明は工程マップにあります。

2規模と用途

3検討する工程に印を付ける19 / 19 工程

採取・初期化

樹立・拡大・バンク化

分化誘導

精製

品質特性・分析

  • 10STR鑑定

    取り違えや他株混入を排し登録ドナー由来の正株であることをDNA指紋で保証する。

    基準の方法
    STR
    試薬・資材
    試薬: Promega PowerPlex Fusion 6C System（DC2705）または Thermo Fisher GlobalFiler PCR Amplification Kit（4476135）等のSTRマルチプレックスPCRキット、サイズスタンダード GeneScan 600 LIZ
    代表的なメーカー
    PromegaQIAGENIlluminaThermo FisherApplied Biosystems
    ほかの方法
    STR-NGS（次世代シーケンシング型STR）・SNPジェノタイピング照合・HLAタイピング
    工程マップで詳しく →

  • 11多能性マーカー・フロー

    バンクが未分化で高品質な多能性状態にあることを陽性率で数値化しロット判定する。

    基準の方法
    多色フローサイトメトリーによる多能性マーカー（SSEA-4、TRA-1-60）陽性率の定量
    試薬・資材
    試薬: 蛍光標識 anti-SSEA-4（BioLegend 330406／BD 560073）、anti-TRA-1-60（BioLegend 330610／Miltenyi 130-100-347）。補完で細胞内 anti-OCT4（BD 560329）・anti-NANOG（BD 561300）。生死判別に BD 7-AAD（559925）
    ほかの方法
    免疫蛍光染色（ICC/IF）・qPCR／RT-qPCRによる多能性遺伝子発現・PluriTest（トランスクリプトーム照合）
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  • 12三胚葉分化能・Scorecard

    三胚葉分化能で多能性を機能的に証明しテラトーマ試験を定量法で置換する。

    基準の方法
    TaqMan hPSC Scorecardアッセイ
    試薬・資材
    試薬: TaqMan hPSC Scorecard Panel（Fast 96-well A15876／384-well A15870等。自己複製・三胚葉系統マーカーの94 TaqManアッセイをドライダウン）、逆転写・PCRに High-Capacity cDNA Kit＋TaqMan Fast Advanced Master Mix
    代表的なメーカー
    IlluminaThermo FisherSTEMCELLApplied Biosystems
    ほかの方法
    テラトーマ形成試験（in vivo）・胚様体（EB）分化＋三胚葉マーカー染色・PluriTest／指向性分化検証
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  • 13ゲノム安定性・核型の評価

    培養で蓄積する染色体異常を全ゲノム概観で監視し腫瘍化・機能異常を防ぐ。

    基準の方法
    Gバンド分染核型解析（メタフェーズ核型）による染色体異常スクリーニング
    試薬・資材
    試薬: コルセミド（KaryoMAX Colcemid、Thermo Fisher 15212012）、ギムザ染色液（Merck/Sigma GS500）、トリプシン処理液、培養試薬
    代表的なメーカー
    Bio-RadMerckIlluminaThermo FisherApplied Biosystems
    ほかの方法
    SNPアレイ（分子核型）・デジタルPCR標的アッセイ（iCS-digital PSC）・全ゲノムシーケンシング（WGS）／NGS
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  • 14ベクタークリアランス確認

    初期化に使ったSendaiや導入因子の残存を高感度に否定し安全性を確認する。

    基準の方法
    RT-qPCRによる残存Sendaiウイルスゲノム／導入トランスジーンの検出（陰性確認）
    代表的なメーカー
    Bio-RadQIAGENRocheThermo Fisher
    ほかの方法
    免疫細胞化学（ICC）によるSeVタンパク検出・エピソーマル/プラスミドDNAのqPCR検出・デジタルPCR（高感度定量）
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  • 15残存未分化細胞・ddPCR

    分化製品に残る未分化iPSCの移植後腫瘍化を極微量レベルで検出する最重要課題。

    基準の方法
    LIN28A標的のデジタルPCR（ddPCR）による残存未分化細胞の超高感度定量
    代表的なメーカー
    Bio-RadThermo FisherBD
    ほかの方法
    RT-qPCR（LIN28A／TRA-1-60転写産物）・培養上清miRNA測定（miR-302b等）・フローサイトメトリー（TRA-1-60／SSEA-5陽性細胞）
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  • 16無菌・マイコ・エンドトキシン

    終末滅菌不能で短有効期間の製品の汚染を防ぐ無菌・マイコ・発熱性の法定試験。

    基準の方法
    無菌試験
    試薬・資材
    試薬: BacT/ALERT iFA Plus（好気）／iFN Plus（嫌気）培養ボトル、Roche MycoTOOL Mycoplasma Real-Time PCR Kit（06495605001）、LAL試薬（ゲル化／比濁／比色）
    ほかの方法
    迅速マイコプラズマqPCR（CAR-T等で承認実績）・組換えファクターC（rFC）法エンドトキシン・迅速微生物検出（ATP生物発光・呼吸検出）
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  • 17エンドトキシン（細菌内毒素）試験

    発熱性のグラム陰性菌内毒素を規格値以下と確認する全ロット必須の安全性試験

    基準の方法
    動態比濁法／比色法によるLALエンドトキシン定量
    試薬・資材
    試薬: Endosafe LAL カートリッジ（動態比色法、感度域 0.005〜10 EU/mL等）、Control Standard Endotoxin（CSE）標準品、LAL Reagent Water
    ほかの方法
    組換えカブトガニC因子（rFC）法・ゲル化法（LALゲルクロット）
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  • 18マイコプラズマ否定試験

    無菌試験では検出できないマイコプラズマ汚染を確認する全ロット必須の安全性試験

    基準の方法
    リアルタイムPCR（NAT）法によるマイコプラズマ核酸検出（薬局方代替法）
    試薬・資材
    試薬: Roche MycoTOOL Mycoplasma Real-Time PCR Kit（06495605001、160 PCR分。内部コントロール・キャリアDNA同梱）または Thermo Fisher MycoSEQ Mycoplasma Detection Kit（4460623）、核酸抽出は MagNA Pure／PrepSEQ
    代表的なメーカー
    RocheThermo Fisher
    ほかの方法
    培養法（寒天平板・液体培地）・指標細胞・DNA染色（Hoechst）法
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  • 19純度・力価／生存率

    目的細胞の純度・同一性を系統マーカーで確認し投与量根拠の細胞数と生存率を測る。

    基準の方法
    系統特異マーカーのフローサイトメトリーによる純度・同一性評価＋生存率
    試薬・資材
    試薬: 系統マーカー抗体（例 心筋 anti-cTnT〔BD 565744〕、RPE anti-PMEL17/anti-TYRP1、NK anti-CD56〔BioLegend 318304〕）、生死判別に BD 7-AAD（559925）または ChemoMetec Via1-Cassette内蔵 AO/DAPI
    ほかの方法
    アクリジンオレンジ／PI法 自動カウント・免疫蛍光／ハイコンテントイメージング・機能的力価アッセイ
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19工程を選んでいます。仕様メモでは、宛先・条件・確認したいことを書き足して、PDF やメールで渡せます。

選んだ19工程で仕様メモを作る

公開情報にもとづく一般的な整理です。基準の方法とメーカーは代表例で、推薦ではありません。実際に要る工程と装置は、規模と規制の方針で変わります。