工程1：セルバンク構築・同一性確認
正しい配列のプラスミドを正しい菌が持つ状態を固定する、全工程の出発点となる同一性確認。
基準法形質転換大腸菌のセルバンク作製＋プラスミド全長配列確認
Standard Process Map遺伝子治療
プラスミドDNA製造 基準工程マップ
この基準工程マップは、プラスミドDNAの製造・分析を大腸菌の発酵→菌体回収・溶菌→精製→品質特性解析の順に整理しています。最適な手法は条件で変わるため、各工程に代替・補完法も併記しています。
製法の条件で切り替える
◇の付いた3工程は、この条件で基準法が変わります。
全体像
工程名を押すと、その工程の説明へ移ります。工程を押すと、その場で詳しい説明が開きます。◇は条件で基準法が変わる工程です。
このマップは、大腸菌で作る環状プラスミドに加えて、大腸菌を使わない無細胞ルート（PCR増幅／酵素合成 doggybone・dbDNA）と共通精製も収録しています。
製法の条件で切り替える
◇の付いた3工程は、この条件で基準法が変わります。
出発原料・細胞バンク（1工程）
培養・産生（1工程）
工程2：本培養・発酵
流加で菌体を高密度に育てコピー数を保ち、最終収量とスーパーコイル率を決める本培養。
基準法流加（フェドバッチ）発酵、規定培地、溶存酸素／pH／温度制御
回収・清澄化（3工程）
工程3：ハーベスト・菌体回収
溶菌前に菌体を濃縮し培地成分を除く標準前処理。再懸濁均一性が回収率を左右する
基準法連続式ディスクスタック遠心またはホローファイバー精密ろ過
工程4：アルカリ溶菌・中和
◇ 分岐溶菌・中和でプラスミドだけを上清に残す粗分離の要。過度な操作はスーパーコイルを壊す。
基準法アルカリ溶菌
熱（サーマル）溶菌では
STET系バッファー（Tris／EDTA／スクロース／Triton X-100）中でリゾチーム前処理した菌体懸濁液を熱交換コイルに通し約70〜100℃で連続溶菌、直後に冷却コイル…
工程5：清澄化・デプスろ過
◇ 分岐中和凝集物とデブリを除き、後段クロマトの目詰まりを防ぐ清澄化。高塩で吸着保持を回避。
基準法深層ろ過（デプスフィルトレーション）→ 0.2 µm 滅菌ろ過
熱（サーマル）溶菌では
熱凝集した細胞デブリ・変性タンパク・ゲノムDNAを連続式遠心または深層ろ過で除去し0.2µm滅菌ろ過
精製（5工程）
工程6：UF/DF・濃縮
希薄液を濃縮しバッファーをクロマト適合に交換し、捕捉の負荷量とロバスト性を高める前処理。
基準法限外ろ過／ダイアフィルトレーション（UF/DF、100〜300 kDa膜）
工程7：沈殿・コンディショニング
◇ 分岐清澄ライセートを直接AEXに負荷すると不純物過多で破綻するため事前沈殿が必須
基準法塩化カルシウム
熱（サーマル）溶菌では
溶菌段階でgDNAが熱沈殿除去される分、後段の選択沈殿の負荷プロファイルが変わる
工程8：キャプチャー／アニオン交換
強い負電荷を利用してプラスミドを捕捉し、HCP・RNA・ゲノムDNAを一段で大きく除く第一クロマト。
基準法アニオン交換クロマトグラフィー（AEX、塩グラジエント溶出）
工程9：ポリッシング／疎水性相互作用
開環状・直鎖アイソフォームとエンドトキシンを除き、スーパーコイル率の規格達成に効く仕上げ。
基準法疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC、高塩吸着・低塩溶出）
工程10：最終ポリッシング・脱塩
HIC後にSECで開環体・凝集体・断片を分離しSC含量90%以上を確保する最終研磨
基準法Sepharose 6 Fast Flow を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによる最終研磨・脱塩
製剤・充填（1工程）
工程11：最終ろ過・フィル＆フィニッシュ
保存用バッファーへ交換し規定濃度に調整、無菌ろ過・充填で安定性と無菌性を決める最終工程。
基準法UF/DFによる最終製剤バッファー交換・濃度調整 → 0.2 µm無菌ろ過 → 無菌充填
品質特性・分析（9工程）
工程12：スーパーコイル含量分析
効力・トランスフェクション効率に効く％SCを測る最重要CQA。概ね80％以上が規格目安。
基準法キャピラリーゲル電気泳動（CGE）によるアイソフォーム定量
工程13：同一性確認
設計どおりの配列・構造を毎ロット保証し、取り違えや変異を排除する核酸医薬の根幹試験。
基準法制限酵素消化マッピング＋配列確認（Sangerまたは全周シーケンス）
工程14：含量・純度／UV測定
濃度を定量し260/280比でタンパク混入を評価する、投与量設計と純度一次判定の項目。
基準法紫外吸光分光（UV、A260で定量・A260/280とA260/230で純度評価）
工程15：残留宿主DNA／qPCR
安全性懸念となる大腸菌ゲノムDNA残量を高感度に定量し規格内を確認する工程由来不純物管理。
基準法宿主ゲノム特異的配列を標的とした定量PCR（qPCR）
工程16：残留HCP／ELISA
免疫原性に関わる大腸菌タンパク残量をELISAで定量し規格適合を示すロット放出項目。
基準法宿主細胞タンパク特異的サンドイッチELISA
工程17：残留RNA分析
定量を狂わせ純度を下げる残留RNAを評価し、クロマトでの除去を最終確認する純度項目。
基準法キャピラリーゲル電気泳動（CGE）またはアガロースゲルによる残留RNA評価
工程18：エンドトキシン試験
強い発熱・免疫反応を起こすエンドトキシンを定量し極低規格に適合させる安全性必須試験。
基準法LALによる細菌内毒素試験（動態比濁／動態発色法）
工程19：無菌・バイオバーデン試験
注射用核酸として生菌の不在と工程菌数を確認し患者安全を担保する薬局方安全性試験。
基準法無菌試験（薬局方）＋バイオバーデン試験（薬局方）
工程20：一般物性試験
外観・pH・浸透圧を確認し、安定性と投与適合性を担保する製剤の基本物性項目。
基準法外観（目視検査）、pH（電位差測定）、浸透圧（氷点降下法）
直鎖状DNA①：PCR増幅ルート（2工程）
工程21：PCR法の出発材料
鋳型とプライマーの設計・純度が、無細胞PCRで作る直鎖状DNAの品質を決める起点。
基準法合成遺伝子フラグメント／プラスミドを鋳型に、目的配列を挟むプライマー対を設計・調製
工程22：PCR法・原薬相当
校正活性ポリメラーゼで忠実度を保ちつつ、無細胞・短時間で直鎖状DNAを増幅する中心工程。
基準法校正活性を持つ高忠実度DNAポリメラーゼによるPCR増幅（ホットスタート・大容量反応）
直鎖状DNA②：酵素合成ルート（3工程）
工程23：環状鋳型の準備・変性
認識配列を組み込んだ環状鋳型を微量用意し、以降を等温・無細胞の増幅に委ねる起点。
基準法認識配列（TelN等）を含む環状鋳型の調製と化学的変性
工程24：ローリングサークル増幅
phi29の鎖置換と校正活性で、環状鋳型を等温・無細胞で大量増幅する酵素合成法の心臓部。
基準法phi29 DNAポリメラーゼによる等温ローリングサークル増幅（RCA／MDA）
工程25：doggybone化
認識配列を切って末端を共有結合で閉じ、閉端の直鎖状DNA（doggybone）に整形する要の酵素工程。
基準法プロテロメラーゼ（TelN）による認識配列の切断・共有結合閉環
直鎖状DNA③：精製・仕上げ（2工程）
工程26：エキソヌクレアーゼ処理
閉端DNAの耐性を利用し、残存する開環・直鎖・一本鎖のDNAを末端から選択的に分解する精製段。
基準法末端依存性ヌクレアーゼ（Plasmid-Safe DNase／Exonuclease III・V・I 等）による残存直鎖DNAの選択的分解
工程27：直鎖状DNA原薬
AEX／モノリスで捕捉・ポリッシュし、UF/DFと無菌ろ過で原薬へ。残存酵素・鋳型・エンドトキシンの除去確認が要。
基準法陰イオン交換（AEX）／モノリスによる捕捉・ポリッシュ＋UF/DF＋無菌ろ過
公開情報にもとづく一般的な整理です。実際の構成は条件により異なります。