抗体医薬（セルフリーADC）の工程チェックリスト
検討する工程に印を付けて、規模と用途を書けば、仕様メモにして代理店やメーカーへ渡せます。工程ごとの詳しい説明は工程マップにあります。
2規模と用途
3検討する工程に印を付ける20 / 20 工程
原料調製
1S30抽出液調製／ライセート調製
抽出液の活性・規格が抗体の収量と折り畳みを律速する出発原料
- 基準の方法
- 高密度発酵で培養したエンジニアード E. coli を高圧ホモジナイズで破砕し、遠心で30,000×g 上清
- 試薬・資材
- 無細胞（セルフリー）タンパク質合成系
- ほかの方法
- 市販E. coli無細胞キット・真核抽出液・凍結乾燥抽出液
2非天然アミノ酸・直交翻訳系の調製
アンバー読み替えで規定位置にアジド足場を入れ均一DARを担保
- 基準の方法
- M. jannaschii 由来の改変 pAMF-tRNA合成酵素とアンバーサプレッサー tRNA を別途 E.…
- ほかの方法
- ケトン-オキシム結合・アジド導入の別経路・天然残基ベース直交化学
無細胞合成
3無細胞翻訳・本反応
ATP再生と酸化還元制御で抗体鎖を一晩翻訳し折り畳みを整える
- 基準の方法
- PANOx-SP型のエネルギー再生
- ほかの方法
- プレファブ軽鎖（PFLC）添加・低コストエネルギー源・連続交換型CFPS（CECF）
折り畳み・組立
4酸化的フォールディング・四量体組立
鎖の正対合とジスルフィド架橋で凝集・断片を抑え品質を作り込む
- 基準の方法
- 酸化還元緩衝
- 試薬・資材
- 酸化還元緩衝: GSSG/GSH（Merck）、Merck DsbC ジスルフィドイソメラーゼ、プレファブ軽鎖。pH7.0–7.5、Mg/K塩で四量体組立を促進
- ほかの方法
- PDI添加・シャペロン共添加・反応後リフォールディング
精製
5ハーベスト・清澄化
S30反応液は菌体片・粒子で混濁し、清澄化せずProtein A負荷は不可
- 基準の方法
- 連続遠心で粗清澄後、深層フィルターで研磨清澄しProtein A供給液を調製
- 試薬・資材
- —（清澄化、必要に応じProtein A平衡化バッファ（例 20 mMリン酸ナトリウム150 mM NaCl pH7.4）で希釈）。HC Proは内毒素LAL干渉のβグルカン低減グレード
- ほかの方法
- デプスフィルター単独清澄（遠心レス）・TFF微孔ろ過清澄化
6プロテインAキャプチャー
Fcで抗体だけを捕捉し抽出液夾雑を落とし純度の大半を確保
- 基準の方法
- プロテインAアフィニティクロマトグラフィー
- ほかの方法
- 他社プロテインAレジン・プロテインG/L代替アフィニティ・アフィニティレス精製
7低pHウイルス不活化・中和
Protein A酸性溶出液は低pH保持と中和を経て初めて後段に供せる標準工程
- 基準の方法
- 溶出液を撹拌容器で規定pH・時間保持後、1–2 M Tris塩基でpH調整し中和
- ほかの方法
- 連続中和（インライン）・酢酸/クエン酸系ホールド＋NaOH希釈
8ポリッシング・バッファ交換
残存凝集体・夾雑を磨きモノマー主体の清浄抗体で結合に備える
- 基準の方法
- 分取サイズ排除クロマトグラフィー
- ほかの方法
- AEXフロースルー研磨・CEX研磨・混合モード研磨（MMC）
9アニオン交換ポリッシング・フロースルー
E. coli系は内毒素・DNA負荷が高く、AEXフロースルー研磨が必須
- 基準の方法
- Q膜アドソーバーをフロースルーモードで運転しIgGを通過、内毒素/DNA/HCPを吸着
- 試薬・資材
- 陰イオン交換レジン（AEX）
- ほかの方法
- 他社Q膜アドソーバー・Q樹脂充填カラムAEX研磨
部位特異的コンジュゲーション
10クリック・コンジュゲーション
アジドとDBCOの銅フリー結合で規定位置・均一DARを実現する中核
- 基準の方法
- 歪み促進アジド-アルキン環化付加（SPAAC, 銅フリークリック）
- ほかの方法
- オキシム結合（pAcF系）・銅触媒クリック（CuAAC）・テトラジン-TCO（IEDDA）
11遊離薬物除去・精製
安全性に直結するCQAの遊離薬物リンカーを確実に除去する
- 基準の方法
- 脱塩・限外ろ過による遊離薬物除去とバッファ交換
- 試薬・資材
- 脱塩樹脂（Zeba High-Performance Resin）、PBS、必要に応じ活性炭（Merck）／疎水樹脂（Purolite/Merck）。遊離薬物・有機溶媒を除去
- ほかの方法
- TFFダイアフィルトレーション・活性炭/疎水樹脂吸着・プロテインA再捕捉
製剤・充填
12製剤化・フィル＆フィニッシュ
安定化処方と無菌充填で疎水性薬物による凝集・分解を抑える
- 基準の方法
- UF/DFで製剤バッファへ交換・濃縮し、界面活性剤(ポリソルベート)・糖等を添加
- ほかの方法
- 凍結乾燥製剤・プレフィルドシリンジ/デバイス充填・凍結原薬（DS）保管＋後充填
13除菌ろ過・最終ろ過
原薬は充填前に0.2 µm除菌ろ過で無菌・バイオバーデン管理が必須
- 基準の方法
- 製剤バルクを0.22 µm PVDFメンブレンフィルターで除菌ろ過し充填工程へ供給
- 試薬・資材
- —（除菌ろ過）。完全性試験用湿潤液（WFI／製剤バッファ）。バブルポイント/拡散流試験で完全性確認
- ほかの方法
- PES二重膜除菌ろ過・PESシングルユースカプセル
品質特性・分析
14DAR・薬物分布測定
DARと分布が効力・安全性を決め均一性をMSで直接確認する
- 基準の方法
- 質量分析によるインタクトDAR測定
- ほかの方法
- 逆相LC還元サブユニットMS・UV/Vis比吸収法・native SEC-MS／CE-MS
15ペプチドマッピング
pAMF組込み位置と占有率を配列で確かめる本モダリティ固有のCQA
- 基準の方法
- トリプシン消化＋LC-MS/MSペプチドマッピング
- ほかの方法
- Middle-down サブユニットMS・ジスルフィド/グリカンマッピング・インタクト/還元質量での組込み確認
16サイズ変異体・凝集体評価
凝集体・断片は効力低下と免疫原性に関わりモノマー純度を監視
- 基準の方法
- 分析SEC-HPLCで%HMW/モノマー/%LMWを定量（280 nm積分）
- ほかの方法
- SEC-MALS・分析超遠心AUC・CE-SDS純度（別装置）
17電荷変異体評価
脱アミドや結合由来の電荷偏りを把握しバッチ間一貫性を示す
- 基準の方法
- イメージドキャピラリー等電点電気泳動(icIEF)で等電点(pI)に基づき酸性/主/塩基性ピークを分離・定量
- 試薬・資材
- 両性担体・pIマーカー（IEF試薬）
- ほかの方法
- イオン交換クロマト（IEX/CEX）・cIEF-MS／CE-MS・従来IEF/cIEFゲル
18結合速度論・親和性測定
結合・親和性とFcRn結合で効力と体内動態への影響を評価する
- 基準の方法
- 表面プラズモン共鳴(SPR)またはバイオレイヤー干渉法(BLI)で結合速度論(ka/kd)・親和性(KD)を測定
- ほかの方法
- ELISA結合アッセイ・フローサイトメトリー細胞表面結合・KinExA（溶液平衡）
19細胞傷害バイオアッセイ／効力試験
内在化から細胞死までの作用機序を反映する最重要の効力指標
- 基準の方法
- 標的抗原陽性がん細胞株を用いた細胞傷害アッセイ
- 代表的なメーカー
- PromegaRevvityPerkinElmerBMG LABTECHThermo Fisher
- ほかの方法
- 内在化アッセイ・カスパーゼ/アポトーシスアッセイ・レポーター遺伝子バイオアッセイ
20工程由来不純物の管理
E.coli抽出液由来のHCP・DNA・内毒素を安全規定値以下に管理
- 基準の方法
- HCPはサンドイッチELISA、残存DNAはqPCR、エンドトキシンはLAL
- 代表的なメーカー
- Cygnus TechnologiesThermo FisherCharles RiverLonzaTecan
- ほかの方法
- HCP質量分析プロファイリング・組換え因子C（rFC）試験・蛍光色素法（残存DNA）
20工程を選んでいます。仕様メモでは、宛先・条件・確認したいことを書き足して、PDF やメールで渡せます。
選んだ20工程で仕様メモを作る公開情報にもとづく一般的な整理です。基準の方法とメーカーは代表例で、推薦ではありません。実際に要る工程と装置は、規模と規制の方針で変わります。